9種金線蓮資源的染色體倍性及其核型分析△

謝卓宓，牛歡，古力，王建明，梁瑩，秦雙雙，李胤嘉，李明杰，3*，張重義，3*

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 作物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023；3.福建農(nóng)林大學(xué) 作物遺傳育種與綜合利用省部共建教育部重點(diǎn)實驗室，福建 福州 350002；4.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

金線蓮Anoectochilusroxburghii(Wall.)Lindl屬蘭科開唇蘭的一種多年生草本植物，別名金線蘭、金絲草。金線蓮作為我國傳統(tǒng)的珍貴藥材，具有除濕解毒、清熱涼血、祛風(fēng)利濕之功效，用于治療咯血、膀胱炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急慢性肝炎、支氣管炎、糖尿病等癥[1-6]。金線蓮在我國的分布主要于亞熱帶地區(qū)，福建省則是我國金線蓮的標(biāo)識性道地產(chǎn)區(qū)，由于金線蓮種子萌發(fā)的苛刻性以及人工的過度采挖，導(dǎo)致現(xiàn)今的野生金線蓮資源幾乎處于瀕危的邊緣[7-10]。近幾年，隨著金線蓮離體快繁技術(shù)的逐漸成熟，金線蓮的人工種植面積正在逐漸擴(kuò)大，栽培技術(shù)也相應(yīng)逐漸成熟。但是在金線蓮的栽培生產(chǎn)上，卻存在種植面積廣而分散、栽培品系多而不精、栽培技術(shù)散而不統(tǒng)等普遍問題。目前，金線蓮品種選育較為雜亂，并且缺乏標(biāo)準(zhǔn)的品種選育體系，大部分栽培品種或品系為資源分離后直接轉(zhuǎn)變而來，導(dǎo)致生產(chǎn)上金線蓮?fù)愇铩⑼锂惷F(xiàn)象較為嚴(yán)重。同時，在金線蓮的培育、生產(chǎn)和加工過程中，人們頻繁使用來路不明的親本，導(dǎo)致主要金線蓮品種雜合退化現(xiàn)象較為嚴(yán)重。因此，詳細(xì)的確定不同金線蓮資源的遺傳背景和遺傳信息，徹底地排查不同地區(qū)金線蓮資源親緣關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系對于解決目前金線蓮生產(chǎn)上的資源混亂的問題具有重要意義?，F(xiàn)今，雖然在金線蓮的研究中已經(jīng)開發(fā)了諸如ISSR、SCAR、RAPD、SRAP等標(biāo)記[11-13]，分子標(biāo)記方法在一定程度上為判明金線蓮的不同資源間的親緣關(guān)系提供了重要的分子手段。但這些標(biāo)記體系由于其自身的缺陷，導(dǎo)致不能對現(xiàn)有金線蓮資源體系，特別是親緣關(guān)系較為相近的變異種而進(jìn)行有效的區(qū)分，并且不能完全的反映出金線蓮的遺傳進(jìn)化信息和背景信息。因此，為了更加精準(zhǔn)的把握金線蓮資源的遺傳基礎(chǔ)，準(zhǔn)確的判明金線蓮遺傳進(jìn)化規(guī)律，詳細(xì)探明金線蓮資源間倍性關(guān)系以及遺傳差異將成為今后金線蓮資源研究必要研究的方向之一。

不同物種細(xì)胞內(nèi)染色體的組成和形態(tài)構(gòu)成了該物種特有的細(xì)胞核型基礎(chǔ)，呈現(xiàn)出了不同物種細(xì)胞的特定遺傳形態(tài)，在進(jìn)化的過程中不受外界環(huán)境因素干擾和影響。因此，一個物種或資源的核型模式在一定程度上反饋出了其進(jìn)化的基本特征[14-16]。染色體核型分析是植物種質(zhì)資源遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容，也是物種進(jìn)化關(guān)系和系統(tǒng)分類的重要參考標(biāo)準(zhǔn)，在研究植物系統(tǒng)分類的起源、演化和鑒別中充當(dāng)了重要的研究手段，目前，金線蓮在細(xì)胞學(xué)上的研究相對較少，加之金線蓮染色體形態(tài)小、數(shù)目多少變幅大等原因，使得金線蓮核型分析較為困難，至今尚未有不同金線蓮資源核型差異方面的研究內(nèi)容。本文采用流式細(xì)胞儀方法對9個不同種質(zhì)資源類型的金線蓮品系倍性特征進(jìn)行初步解析，同時，利用去壁低滲-火焰干燥法[17]對不同金線蓮品系進(jìn)行染色體制片和核型分析。本研究為進(jìn)一步詳細(xì)研究金線蓮資源的類群劃分和優(yōu)良品系的選育提供重要的數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。同時，也為蘭科植物的演化、進(jìn)化特征和遺傳規(guī)律的研究提供重要的細(xì)胞學(xué)佐證。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇福建等地區(qū)9種廣泛種植的金線蓮品種(系)資源作為實驗材料，9種金線蓮資源分別命名為GXHZ、GXJX、GXDY、FJQG、FJTN/1、FJTN/2、FJCY、FJSM、FJJY，所有金線蓮種質(zhì)資源材料均用組培體系進(jìn)行保存，并由福建農(nóng)林大學(xué)鄒小興(副教授)認(rèn)證為金線蓮(表1，圖1)。

圖1 9種不同種質(zhì)資源金線蓮表型圖

1.2 方法

1.2.1 染色體條數(shù)的鑒定 采用去壁低滲-火焰干燥法[17]對不同品系金線蓮的染色體數(shù)目進(jìn)行鑒定分析。選取金線蓮莖段接種后30～60 d的組培幼苗乳白色根尖，用涓流小心清洗掉組培苗根基上的殘渣，放置于0.002 mol·L-18-羥基喹啉室溫下避光處理2～4 h，之后轉(zhuǎn)入現(xiàn)配的卡諾氏固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)在室溫下固定3～4 h。結(jié)束之后再用70%酒精清洗，并于-20 ℃保存。開始制片之前，將低溫保存的材料恢復(fù)至室溫后，濾去酒精，并用蒸餾水沖洗3次。截取根尖置于酶解液中，37 ℃恒溫酶解1～1.5 h；加入冷蒸餾水沖洗后轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液中。用移液槍將截取的根尖均勻吸附到載玻片上，將玻片快速通過火焰，完成制片。將所制玻片經(jīng)DAPI 染色后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，選擇細(xì)胞內(nèi)分散度相對較好的染色體，在100倍油鏡下對分散較好的染色體細(xì)胞進(jìn)行拍照。

1.2.2 核型分析及數(shù)據(jù)處理 以不同金線蓮資源的細(xì)胞染色體拍攝圖為基礎(chǔ)，根據(jù)染色體長度、長短臂的差值、著絲點(diǎn)位置等進(jìn)行同源染色體配對，并由長到短依序進(jìn)行排序，繪制不同金線蓮染色體的核型圖。同時，根據(jù)單一細(xì)胞內(nèi)不同染色體所測長度的平均值繪成核型模式圖。根據(jù)李懋學(xué)等[18]的方法對不同資源金線蓮的核型進(jìn)行分析，觀察同一資源材料根尖至少30個以上的細(xì)胞內(nèi)的染色體條數(shù)，如果85%以上的細(xì)胞具有恒定一致的染色體個數(shù)，即可確證該資源材料的染色體具體條數(shù)。此外，參照韓春艷等[19]、Arano[20]的方法計算核型不對稱系數(shù)，并利用Stebbins[21]的標(biāo)準(zhǔn)確定核型的類別。染色體分類(著絲點(diǎn)位置命名)則參照Levan[22]的命名法。具體計算公式如下：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

1.2.3 染色體核型近似系數(shù) 根據(jù)譚遠(yuǎn)德、吳昌謀[23-24]等方法，選取染色體相對長度的極差、相對長度方差、臂比值的倒數(shù)均值、臂比值的倒數(shù)方差、著絲點(diǎn)指數(shù)均值等參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行核型似近系數(shù)(resemblance-near coefficient，λ)和進(jìn)化距離(evolution distance，De)計算，并利用Ntsys-pc2.1軟件對不同金線蓮資源進(jìn)行聚類分析。

1.2.4 染色體倍性鑒定 以鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo標(biāo)準(zhǔn)二倍體為對照，取0.5 cm2金線蓮新鮮待測植物葉片組織，置于培養(yǎng)皿中，同時，在植物葉片周圍，加入400 μL Partec CyStain UV Precise P 裂解液，并用刀片將葉片切碎，以充分提取出完整的細(xì)胞核，提取時間設(shè)置為10 s。最后將切碎葉肉組織及裂解葉混合物用30 μm 濾網(wǎng)過進(jìn)行濾，將過濾液收集至樣品管內(nèi)，并同步向樣品管中加入Partec CyStain UV Precise P 染液1600 μL進(jìn)行染色，時間為10 s。用CyFlow Space機(jī)型流式細(xì)胞儀(Sysmex Partec)結(jié)合上述提取液進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同金線蓮資源染色體的倍性分析

為了詳細(xì)了解不同金線蓮資源的遺傳基礎(chǔ)差異，本研究選取了9種葉片表型具有明顯差異的金線蓮資源(圖1)，通過流式細(xì)胞術(shù)對9個金線蓮資源倍性進(jìn)行初步判定。倍性分析時以遺傳背景和倍性相對清晰的2倍體石斛材料作為對照，將對照的第一個熒光強(qiáng)度峰值位置設(shè)定在100(橫坐標(biāo))，隨機(jī)選取每個金線蓮資源組織中4000個細(xì)胞進(jìn)行檢測，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)第一個出現(xiàn)的熒光強(qiáng)度峰值與對照的熒光強(qiáng)度峰值的比值來判斷其倍性(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9種不同金線蓮種質(zhì)資源在200～400(橫坐標(biāo))位置之間的熒光強(qiáng)度皆有峰值，但所有材料的第一個熒光強(qiáng)度峰值位置基本處在200(橫坐標(biāo))，與對照材料比值為2，因此本研究所選用金線蓮資源倍性初步判斷皆為4倍體。

圖2 9種不同金線蓮流式細(xì)胞檢測結(jié)果

2.2 不同金線蓮資源的染色體形態(tài)分析

染色體條數(shù)和相應(yīng)的核型組成是構(gòu)成不同物種遺傳信息基礎(chǔ)，為了詳細(xì)鑒定不同金線蓮資源的染色體條數(shù)，本研究利用染色體核型分析技術(shù)詳細(xì)鑒定了9種金線蓮資源的核型組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)9種金線蓮資源的染色體按照條數(shù)可以清晰的分為兩組，一組為80條(2n=80)，主要包括GXHZ 、GXJX 、FJTN/1、FJJY；另外一組染色體條數(shù)均為40條(2n=40)，主要包括GXDY 、FJQG、FJSM、FJTN2、 FJCY(圖3)。通過對不同金線蓮資源染色體的形態(tài)進(jìn)行仔細(xì)觀察，發(fā)現(xiàn)9種金線蓮資源材料染色體形態(tài)均較為微小，屬于較為原始核型類型，著絲點(diǎn)位置不易分辨。其中，染色體中部著絲點(diǎn)(m)相對明顯，未發(fā)現(xiàn)正中部著絲點(diǎn)(M)和隨體。在GXHZ、GXDY、FJTN/1、FJTN/2、FJCY、FJSM、FJJY等金線蓮資源中可以明顯的觀察到短染色體(S)、中短染色體(M1)、中長染色體(M2)、長染色體(L)等不同染色體類型；GXJX、FJQG等 2個金線蓮資源中，觀察到染色體大部分為中短染色體(M1)、中長染色體(M2)等染色體類型，沒有觀察到短染色體(S)(表2、圖4)。

注：所有標(biāo)尺為20 μm。圖3 金線蓮常規(guī)熒光形態(tài)及熒光核型

2.3 不同金線蓮資源的染色體核型分析

在已獲染色體核型的基礎(chǔ)上，通過分析不同資源材料染色體長度、染色體長度比等不同參數(shù)可以初步的了解不同資源的遺傳差異和進(jìn)化秩序。同時，也可以根據(jù)具中部著絲點(diǎn)染色體的百分比與核型不對稱系數(shù)的比值來分析物種的進(jìn)化水平，比值越小表示樣品進(jìn)化水平越高。通過對9種金線蓮的染色體長度分析發(fā)現(xiàn)，不同金線蓮染色體長度變化不大。同時，分析臂比值大于2的染色體比例可以發(fā)現(xiàn)大部分材料比值位于0～0.325之間(表2)。臂比值可以衡量染色體對長度和對稱性差異，可以從側(cè)面反饋出物種進(jìn)化進(jìn)化程度。本研究9個金線蓮資源臂比值大于2的染色體比例基本接近表明實驗中所用材料進(jìn)化程度較為接近。此外，通過分析不同遺傳材料間染色體對稱性和對稱系數(shù)可以初步的解析不同遺傳資源間的進(jìn)化關(guān)系。本研究結(jié)合核型類型分析和核型不對稱系數(shù)分析等方面的結(jié)果顯示，核型不對稱系數(shù)比較大的是GXDY、FJQG、FJTN/2與FJSM，數(shù)值都在60以上，其次的核型不對稱系數(shù)也都在55左右，說明不同金線蓮資源間遺傳基礎(chǔ)存在著一定的差異。此外，根據(jù)Stebbins等的核型分類法[21]，不同植物染色體的核型按對稱性程度的高低可分為 12種類型，即：1A，2A，3A，4A；1B，2B，3B，4B；1C，2C，3C，4C。從不同金線蓮樣品核型的參數(shù)進(jìn)行綜合判定分析，發(fā)現(xiàn)本研究9個樣品絕大多數(shù)染色體的核型皆為2B型。

表2 金線蓮染色體的核型參數(shù)

圖4 金線蓮核型模式圖

根據(jù)核型似近系數(shù)的計算結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2，圖5)，9種金線蓮資源可以明顯的聚成3組，第一組主要包括FJQG、FJJY；第二組為FJTN/1、FJTN/2與GXJX；其余的為第三組。其中，F(xiàn)JJY與FJTN/2的似近系數(shù)數(shù)值最大為0.986，說明FJJY與FJTN/2的親緣關(guān)系最近，或者可以說來源于同一資源后代。另外，F(xiàn)JSM與GXJX似近系數(shù)數(shù)值最小為0.473，表明 FJSM與GXJX親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表3 不同類型金線蓮的核型似近系數(shù)(λ)和進(jìn)化距離(De)

注：λ為核型似近系數(shù)；De為進(jìn)化距離。圖5 9種金線蓮核型似近系數(shù)聚類分析

3 討論

金線蓮屬于典型蘭科植物，有著較為豐富的遺傳資源，但是現(xiàn)今研究主要集中在金線蓮藥效成分分析、離體快繁、栽培技術(shù)方面[25-27]，有關(guān)于金線蓮染色體鑒定及核型分析等相關(guān)方面的研究較少。曾雅娟[28]利用常規(guī)壓片的方法發(fā)現(xiàn)金線蓮染色體數(shù)為2n=40，核型公式為 2n=40=38m+2sm，屬于2A型核型。王麗芳等[29]用同樣的方法鑒定金線蓮的染色體數(shù)為40條，并用秋水仙素將植株染色體數(shù)成功加倍為80條。本研究選擇了福建地區(qū)分布較為廣泛、代表性較強(qiáng)、性狀差異較為明顯的9種金線蓮資源，從細(xì)胞學(xué)水平上詳細(xì)鑒定不同金線蓮遺傳資源間染色體條數(shù)及其核型構(gòu)成差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)9種金線蓮資源的染色體條數(shù)為2n=40和2n=80條2種類型。其中染色體數(shù)目為2n=80的類型主要包括GXHZ、FJTN/1、FJJY和GXJX 4個金線蓮資源；染色體數(shù)目為2n=40的類型主要包括FJCY、FJQG、FJSM等5個金線蓮資源。通過細(xì)胞倍性分析發(fā)現(xiàn)，2個 類型金線蓮資源皆為4倍體，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果同樣證實了所選金線蓮資源均為4倍體。在同一地區(qū)金線蓮資源會出現(xiàn)染色體數(shù)量的多寡變化可能受到多種因素的影響，比如：可能是由于金線蓮在進(jìn)化過程中的自然加倍或自然雜交造成的；也可能是金線蓮在人工選育時人工培育體系造成的；也可能是因為不同的物種或是同一個物種的不同細(xì)胞之間有絲分裂的各個時期不同而產(chǎn)生變化。此外，目前大部分金線蓮品種選育缺乏系統(tǒng)的育種程序，大部分品系均來自于野生資源的優(yōu)良變異類型或野生材料的多代培育材料。不同研究人員在采樣或繁殖時，通常會采用花粉直接繁殖用于快速保存所獲的野生資源，這種方式也可能會造成倍數(shù)型差異。金線蓮倍性差異為豐富金線蓮的遺傳資源和培育優(yōu)異金線蓮品種提供了重要的親本材料。本研究所用金線蓮種質(zhì)資源大多采自林下的野生生態(tài)環(huán)境，核型構(gòu)成存著較大差異，這種差異反饋出金線蓮遺傳資源的多樣性和進(jìn)化的特殊性。

在被子植物中核型進(jìn)化往往是由對稱向不對稱的方向變化，在系統(tǒng)演化位置上越古老的物種其核型越對稱，越進(jìn)化的物種，其核型越偏向不對稱[26]。根據(jù)李懋學(xué)[18]的核型分類標(biāo)準(zhǔn)，本研究所獲取的9種金線蓮資源均為2B型，與曾雅娟[28]等所鑒定的2A型不同，這可能主要是由于在研究金線蓮的核型構(gòu)成時所選取的研究材料不同所致。在金線蓮核型分析中，由染色體平均長度可知，金線蓮染色體屬于小染色體類型，并且未發(fā)現(xiàn)隨體的存在。在物種核型研究中，可以用具有中部著絲點(diǎn)染色體的百分比與核型不對稱系數(shù)的比值來衡量物種的進(jìn)化程度，比值越小也就越進(jìn)化[30]。本研究所鑒定的9個金線蓮資源的核不對稱系數(shù)大部分位于54～65之間，進(jìn)化起源上相對較早。9種不同種質(zhì)資源在進(jìn)化程度上各有差異，而這些差異有可能是因為他們的染色體組型特征或者血緣組成的差異導(dǎo)致。同時，這種差異也有可能在不同程度上反應(yīng)出了不同種質(zhì)資源類型在生態(tài)適應(yīng)性上的差異，比如：FJQG、FJSM進(jìn)化程度較為先進(jìn)，其生態(tài)適應(yīng)性可能更好，可能更適合于引種。通過對樣品的核型分析，我們可以對今后的金線蓮引種提供了一項可靠的依據(jù)。而且，物種的進(jìn)化是以適應(yīng)生境的變化為前提的，外界生存環(huán)境的變化是物種進(jìn)化的直接驅(qū)動力。因此，結(jié)合物種進(jìn)化的先進(jìn)程度，可以從側(cè)面窺視出物種隨著自然環(huán)境變化與其自身在遺傳水平上的響應(yīng)、調(diào)整和適應(yīng)的變化規(guī)律。根據(jù)物種的這種規(guī)律尺度反推重現(xiàn)則可以為藥用植物仿野生栽培技術(shù)體系中品種的選擇和契合生境的優(yōu)化提供重要的參考依據(jù)。

目前，在藥用植物栽培中，詳細(xì)的追尋栽培藥用植物進(jìn)化的生態(tài)足跡，了解野生藥用植物到栽培藥用植物之間生境變遷規(guī)律，實行仿野生栽培技術(shù)體系的構(gòu)建，已經(jīng)成為實現(xiàn)藥用植物的藥性回歸和安全生產(chǎn)的重要技術(shù)保障。金線蓮大多數(shù)棲息于林下陰生環(huán)境，決定其進(jìn)化耐陰性和對林下復(fù)雜生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性。特別是隨著金線蓮仿野生栽培技術(shù)的逐漸推廣，如何篩選和培育出耐陰抗逆性較強(qiáng)的種質(zhì)資源已經(jīng)成為金線蓮發(fā)展的重要瓶頸性問題。因此，后續(xù)的研究可以將植物形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)與現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合，將會更加準(zhǔn)確地對金線蓮資源的系統(tǒng)進(jìn)化以及血緣關(guān)系作出更加客觀的評價，為培育優(yōu)質(zhì)、適產(chǎn)和高適應(yīng)的金線蓮品種奠定基礎(chǔ)。

致謝：感謝作物生態(tài)與分子生理學(xué)福建省高校重點(diǎn)實驗室(福建農(nóng)林大學(xué))對本研究支持；感謝福建農(nóng)林大學(xué)王凱教授課題組對金線蓮染色體核型研究的指導(dǎo)。