HPLC法測定蒙藥藍(lán)盆花中木犀草素和芹菜素的含量

王國英，薛培鳳，布仁，高建萍（.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，呼和浩特00059；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，呼和浩特 000）

蒙藥藍(lán)盆花又稱蒙古山蘿卜花，來源于川續(xù)斷科植物窄葉藍(lán)盆花Scabiosa comosa Fisch.Ex Roem.et Schult和華北藍(lán)盆花Scabiosa tschilliensis Grunning的干燥花序，蒙藥名為陶森-陶日莫，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、河北等省區(qū)[1～3]。蒙醫(yī)在臨床上用其清熱、清“協(xié)日”，主要用于治療肺熱、肝熱、咽喉熱[4]、肝火頭痛、發(fā)燒、肺熱咳嗽、黃疸等病[5]。

藍(lán)盆花中含有黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理研究證明其總黃酮具有抗炎、解熱、抗氧化、對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用、鎮(zhèn)靜、舒張外周血管、降低血壓、免疫、胰脂肪酶抑制作用等功能[6，7]。木犀草素具有消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等作用[8]；芹菜素具有抗腫瘤、抗炎、降血壓、舒張血管、抗動(dòng)脈硬化、抗焦慮、抗菌、抗病毒等作用[9]。兩者藥理作用與藍(lán)盆花的藥理作用相近。因此，建立同時(shí)測定藍(lán)盆花中木犀草素與芹菜素的含量測定方法，對(duì)蒙藥藍(lán)盆花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究具有重要意義。

1 儀器與試藥

HITACHI L-2000高效液相色譜（HPLC）儀，含二元泵、二極管陣列檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱（日本日立公司）；DZKW-D-2電熱恒溫不銹鋼水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；AL-204電子天平（上海微川精密儀器有限公司）；AS3120超聲清洗機(jī)（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；RE-52 c旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

木犀草素、芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品（北京偉業(yè)科創(chuàng)科技有限公司，純度均＞98%）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。7批（批號(hào)：20080709、20090321、20090815、20090720、20090918、20090729、20090701）不同產(chǎn)地和商品藍(lán)盆花樣品，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院龐秀生教授鑒定均為川續(xù)斷科植物華北藍(lán)盆花S.tschilliensis Grunning的干燥花序。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸（59∶41）[10]；流速：1mL·min－1；柱溫：30℃；檢測波長：345 nm；進(jìn)樣量：20 μL。色譜見圖1。

2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別取經(jīng)40℃減壓干燥至恒重的木犀草素和芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含木犀草素0.476 mg、芹菜素0.475 mg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 供試品溶液的制備

取本品粗粉（粉碎，過40目篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加85%甲醇60 mL，85℃回流提取2次，每次2 h，濾過，洗凈藥渣，減壓回收溶劑至干，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，精密吸取3、6、9、12、15、18 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。以對(duì)照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得木犀草素和芹菜素的回歸方程分別為Y＝2×107X+28601（r＝0.9995，n＝6）、Y＝2×107X－5798.1（r＝0.9996，n＝6）。結(jié)果表明，二者進(jìn)樣量分別在0.143～0.857、0.143～0.855 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算峰面積。結(jié)果，木犀草素的RSD＝1.03%（n＝5），芹菜素的RSD＝0.95%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，照上述色譜條件測定。結(jié)果，木犀草素含量的RSD＝1.28%（n＝6），芹菜素含量的RSD＝0.97%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，分別于制備后0、1、2、3、4、6、8 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，木犀草素的RSD＝1.52%（n＝7），芹菜素的RSD＝1.27%（n＝7），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的同一批樣品（批號(hào)：20080709）適量，共6份，精密稱定，分別按相當(dāng)于藥材含量50%的量加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

取不同批次的樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備3份供試品溶液，照上述色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品中木犀草素和芹菜素的含量，結(jié)果見表2。

由表2可見，批號(hào)為20090701的樣品中木犀草素和芹菜素的含量較低，可能是由于采集時(shí)間為7月初，正值花蕾初期（藍(lán)盆花的花期在7～9月），所以含量較低。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

木犀草素和芹菜素在340、350 nm波長處均有較大吸收，但由于木犀草素在350nm波長處的吸收峰最大，芹菜素在340 nm波長處的吸收峰最大，綜合考慮，選擇345 nm作為檢測波長。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery of test（n＝6）

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3.2 提取方法考察

本試驗(yàn)首先對(duì)超聲提取方法和回流提取方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明回流提取效果要比超聲提取效果好。隨后又通過四因素三水平正交試驗(yàn)對(duì)回流提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，因素水平分別為甲醇濃度（100%、85%、70%）、物料比（20、40、60）、提取時(shí)間（1、1.5、2 h）、提取次數(shù)（1、2、3次），得出最優(yōu)試驗(yàn)條件：濃度為85%的甲醇作為提取溶劑，物料比為60，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為2次。

3.3 柱溫的選擇

在其他條件固定的情況下，設(shè)定不同的柱溫進(jìn)行考察。結(jié)果，當(dāng)柱溫為30℃時(shí)，色譜峰基線穩(wěn)定、保留時(shí)間適中、分離度好，因此確定合適的柱溫為30℃。

綜上，本方法準(zhǔn)確、簡便、靈敏度高、重復(fù)性好、易于普及，可以用于蒙藥藍(lán)盆花中木犀草素和芹菜素的含量測定。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草（蒙藥卷）[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004：385.

[2]中國藥品生物制品檢定所，云南省藥品檢驗(yàn)所.中國民族藥志（第3卷）[M].成都：四川民族出版社，2000：523-528.

[3]羅布桑.蒙藥學(xué)[M].北京：民族出版社，1991：375-376.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊(cè)[S].1998：52.

[5]內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳.內(nèi)蒙古藥材標(biāo)準(zhǔn)[M].赤峰：內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社，1987：502.

[6]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草（第7卷）[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：587-588.

[7]Zheng Q，Koike K，Han LK，et al.New biologically active triterpenoid saponins from Scabiosa tschiliensis[J].J Nat Prod，2004，67（4）：604.

[8]李星霞，郭 澄.木犀草素的藥理活性研究[J].中國藥房，2007，18（18）：1421.

[9]孫 斌，瞿偉菁，張曉玲.芹菜素的藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材，2004，27（7）：531.

[10]王錦軍，孔亞梅，劉 娥，等.RP-HPLC法同時(shí)測定香薷中游離黃酮化合物的含量[J].中國藥房，2010，21（15）：1413.