山羊皰疹病毒Ⅰ型的分離鑒定與致病性

郝 飛，毛 立，李文良*，李基棕，楊蕾蕾，張紋紋，孫 敏，鐘純燕,2，劉茂軍，江杰元*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014； 2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

山羊皰疹病毒Ⅰ型(caprine herpesvirus 1，CpHV-1)是皰疹病毒科皰疹病毒甲亞科水痘病毒屬的雙鏈DNA病毒[1-2]。該病毒感染成年山羊后表現(xiàn)為亞臨床感染，可導(dǎo)致產(chǎn)生不同的癥狀，包括呼吸系統(tǒng)疾病、發(fā)熱和白細(xì)胞減少，外陰陰道炎和包皮龜頭炎[3]。懷孕3至4個(gè)月的山羊感染后可誘發(fā)流產(chǎn)。新生羔羊表現(xiàn)嚴(yán)重感染，主要癥狀為發(fā)熱、結(jié)膜炎、眼分泌物增多、呼吸困難、腸道潰瘍性和壞死性病變，并伴隨著較高的發(fā)病率和死亡率[4]。1974年，CpHV-1首先在美國(guó)加利福尼亞表現(xiàn)為腸炎的新生羔羊病料中分離到[5]，此后相繼在歐洲、大洋洲和南美洲出現(xiàn)該病毒的流行[6-9]。此前我國(guó)一直沒有該病報(bào)道。

2013年至2014年，江蘇多地山羊養(yǎng)殖場(chǎng)育肥山羊陸續(xù)出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主的疾病，發(fā)病率與死亡率較高，藥物治療效果較差。病羊主要表現(xiàn)為精神沉郁、流漿液或膿性鼻液、逐漸消瘦，剖檢可見肺部出現(xiàn)不同程度病變。通過實(shí)際調(diào)查、多次采樣，對(duì)樣品中可能的相關(guān)病原進(jìn)行了檢測(cè)，在多數(shù)樣品中檢出山羊副流感病毒3型(CPIV3)[10]，同時(shí)還檢出了一種未知DNA病毒，通過對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行病毒分離鑒定、純化，獲得一株CpHV-1中國(guó)分離株，將其命名為JSHA1405。采用山羊人工感染試驗(yàn)研究該病毒在本屬動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制、排毒、臨床癥狀等情況，以期為規(guī)?；B(yǎng)羊呼吸道疫病的病原學(xué)研究以及該病的防控技術(shù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料與試劑

病料為2014年采自江蘇某山羊養(yǎng)殖場(chǎng)具有呼吸道癥狀的鼻拭子樣本(共12份)，-80 ℃保存；牛腎傳代細(xì)胞(MDBK)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。病毒核酸提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、LATaq酶、pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

1.2 PCR檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明書提取鼻拭子總DNA，PCR擴(kuò)增CpHV-1gB基因，PCR總體積20 μL，其中2×GC Buffer 10 μL，dNTP 2 μL，LATaq酶0.2 μL，上下游引物各1 μL(F：5′-TCGAAGGCCGAGTACCTGCG-3′，R：5′-CCAGTCCCAGGCCACGGTCAC-3′)，DNA模板2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，并拍照記錄。

1.3 病毒的分離與純化

將鼻拭子樣本經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，接種于MDBK單層細(xì)胞培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)。無(wú)CPE則于4 d收毒，繼續(xù)盲傳直至出現(xiàn)穩(wěn)定的CPE。按參考文獻(xiàn)[11]中的方法進(jìn)行病毒蝕斑純化，經(jīng)三輪純化后將最后一次挑取的蝕斑接種于MDBK細(xì)胞上擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)鑒定后作為第一代純化病毒。

1.4 病毒粒子的形態(tài)學(xué)鑒定

收獲感染第4代病毒的MDBK細(xì)胞培養(yǎng)物200 mL，12 000 r·min-1離心30 min去除細(xì)胞碎片，上清經(jīng)40 000 r·min-1超速離心2 h，沉淀用PBS溶解過夜。加樣于銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸負(fù)染后，透射電子顯微鏡(Tecnai 12，PHILIPS)下觀察病毒粒子形態(tài)。

1.5 gB基因克隆及進(jìn)化分析

根據(jù)GenBank不同毒株基因序列設(shè)計(jì)引物分兩段擴(kuò)增完整的CpHV-1gB基因：F1 5′-GTGCCCCAGCGGCGTCTACCTAA-3′，R1 5′-CGCCAGGTACGTGTCCGTCTTCCC-3′；F2 5′-CGGGACGAA-AGTCGCGGAAAC-3′；R2 5′-TCATGCCCCCCCGA-CGTC-3′。PCR體系總體積20 μL，其中2×GC Buffer 10 μL，dNTP 2 μL，LATaq酶0.2 μL，上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，52 ℃(F1、R1)/48 ℃(F2、R2) 1 min，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物純化后克隆至pMD18-T載體，陽(yáng)性質(zhì)粒送南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank上其他反芻動(dòng)物α-皰疹病毒毒株的gB基因序列進(jìn)行比對(duì)，用MEGA5.1軟件采用Neighbor-joining(NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析分離株與其他毒株的進(jìn)化關(guān)系。

1.6 人工感染試驗(yàn)

將純化后第4代病毒液(TCID50為 10-6.5·100 μL-1)以肌內(nèi)注射3 mL的方式感染陰性山羊5只，另設(shè)5只 作為陰性對(duì)照組，按相同劑量和方法接種MDBK細(xì)胞培養(yǎng)上清。攻毒后兩組分圈飼養(yǎng)，觀察35 d，每天定時(shí)測(cè)定直腸溫度，觀察并記錄各組山羊的臨床癥狀。攻毒后第1、3、5、7、9、12、14、16、19、21、28、35天采集各組山羊的鼻拭子、肛拭子及血清樣品。采用“1.2”中的方法檢測(cè)鼻拭子、肛拭子排毒情況，并按“1.3”中方法將陽(yáng)性樣品在MDBK細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離。按照參考文獻(xiàn)[12]中的方法進(jìn)行血清中和抗體檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR檢測(cè)與病毒分離

共采集12份鼻拭子樣品，PCR檢測(cè)到9份陽(yáng)性。將陽(yáng)性病料接種MDBK細(xì)胞后，盲傳至第3代時(shí)，在接毒后24～48 h產(chǎn)生明顯CPE。傳至第5代后可出現(xiàn)穩(wěn)定的CPE。接毒后24 h可見細(xì)胞腫脹，失去光澤，部分細(xì)胞出現(xiàn)折光性增強(qiáng)，變圓變亮；接毒后36 h，部分細(xì)胞發(fā)生脫落，死亡(圖1B)；接毒后48 h 80%細(xì)胞發(fā)生脫落。

2.2 分離毒株的形態(tài)學(xué)及核酸鑒定

電鏡觀察超離純化后的病毒，可見直徑約100 nm 球狀有囊膜的病毒顆粒(圖1C)，符合反芻動(dòng)物α-皰疹病毒的一般形態(tài)特征。

擴(kuò)增分離毒株gB基因完整閱讀框序列，測(cè)序得到2 763 bp的編碼序列，將此gB基因序列與GenBank上山羊皰疹病毒Ⅰ型(CpHV-1)、牛皰疹病毒Ⅰ型不同基因型毒株(BoHV-1、BoHV-1.1、BoHV-1.2、BoHV-5、BuHV-1)及鹿皰疹病毒1型(CvHV-1)的相應(yīng)基因序列進(jìn)行相似性對(duì)比分析。結(jié)果表明：分離毒株JSHA1405gB基因與CpHV-1 E/CH株gB基因相似性最高，為99.2%；與BoHV-1 Salla82株相似性最低，為84.7%。進(jìn)化分析結(jié)果表明JSHA1405株與CpHV-1 E/CH株同屬一個(gè)分支，屬于山羊皰疹病毒Ⅰ型，系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2所示。

綜上判定，分離毒株JSHA1405為山羊皰疹病毒Ⅰ型。

A.正常MDBK細(xì)胞(36 h)；B.接毒后36 h細(xì)胞；C.電子顯微鏡下病毒粒子形態(tài)A. Normal MDBK cells for 36 hours; B. The MDBK cells inoculated virus for 36 hours; C. Virion observed by TEM圖1 細(xì)胞及病毒粒子形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Cells and virion morphology observation

2.3 人工感染試驗(yàn)

攻毒組山羊(CC)在感染病毒后第1天開始出現(xiàn)體溫升高(>40 ℃)，發(fā)熱過程最長(zhǎng)可持續(xù)至攻毒后10 d(圖3)，體溫最高可達(dá)41.8 ℃。感染病毒后第3天攻毒組山羊開始出現(xiàn)呼吸道癥狀并持續(xù)到第12天，羊群表現(xiàn)為精神沉郁、流漿液性或膿性鼻涕(表1)。此外，攻毒組山羊可以通過鼻腔和糞便排毒，感染后3 d可在鼻拭子和肛拭子中檢測(cè)到病毒，排毒可持續(xù)6 d左右(表1)。將檢測(cè)為陽(yáng)性的條帶回收后測(cè)序，結(jié)果顯示擴(kuò)增毒株為CpHV-1。陽(yáng)性樣品接種MDBK細(xì)胞能產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞病變，PCR檢測(cè)為CpHV-1。對(duì)照組山羊(NC)表現(xiàn)正常且未檢出排毒(圖3、表1)。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，山羊在攻毒后第7天出現(xiàn)中和抗體，第28天達(dá)到最高峰，抗體效價(jià)最高可達(dá)1 024；對(duì)照組山羊未檢測(cè)到中和抗體(表1)。

▲. 本試驗(yàn)分離毒株▲. Isolated strain圖2 反芻動(dòng)物皰疹病毒gB基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree inferred by nucleotide sequences from the gB regions of ruminant alphaherpesviruses

圖3 羊群體溫變化圖Fig.3 Rectal temperature measurement in goats

3 討 論

近年來(lái)，中國(guó)肉羊養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，規(guī)模化舍飼已成為我國(guó)肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要模式之一。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，飼養(yǎng)密度的增加，疾病防控面臨著越來(lái)越大的壓力。呼吸道疾病是危害養(yǎng)羊業(yè)尤其是圈舍養(yǎng)羊的重要疫病之一[13]，目前對(duì)相關(guān)致病病原的研究主要集中在小反芻獸疫病毒、支原體、山羊副流感病毒3型以及巴氏桿菌等方面[10,14-18]。山羊皰疹病毒Ⅰ型(CpHV-1)可引起羔羊出現(xiàn)致命全身性感染以及成年山羊亞臨床呼吸道和生殖系統(tǒng)感染[3-4]，該病于1974年首次在美國(guó)出現(xiàn)，5年后在瑞士也發(fā)現(xiàn)該病毒感染。雖然對(duì)該病毒的全球流行分布情況尚未進(jìn)行系統(tǒng)研究，但是歐洲、澳大利亞、新西蘭、加拿大和巴西已陸續(xù)報(bào)道該病毒感染的存在。本病在地中海沿岸國(guó)家分布比較廣泛，在這些國(guó)家檢測(cè)到了較高的抗體陽(yáng)性率(希臘超過50%，西班牙為21%，意大利南部為60%)，最新研究報(bào)道在法國(guó)本土南部地區(qū)也出現(xiàn)該病毒感染[9,19]。我國(guó)此前沒有該病的報(bào)道，也沒有對(duì)其進(jìn)行相關(guān)調(diào)查。

表1 各組山羊臨床癥狀、排毒情況和中和抗體滴度檢測(cè)結(jié)果

a. 采樣時(shí)間，數(shù)字是幾就是指第幾天所采樣品；-.正常；+.輕度；++.中度

a. Sampling time, the number refers to the sample taken on that day. -. Normal; +. Mild; ++. Moderate

國(guó)外研究表明，高養(yǎng)殖密度、快速育肥的養(yǎng)殖模式以及與其他病毒共感染是引起CpHV-1感染的幾大風(fēng)險(xiǎn)因素[19]。本研究采集具有呼吸道癥狀的育肥羊鼻拭子樣本，經(jīng)病原學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在CpHV-1感染，同時(shí)也檢測(cè)到了CPIV3和綿羊肺炎支原體感染存在。該結(jié)果與國(guó)外研究相佐證，同時(shí)也提示導(dǎo)致2013—2014年江蘇多地規(guī)?；犸暱焖儆恃蛉寒a(chǎn)生嚴(yán)重呼吸道癥狀的病原是多樣的，在高養(yǎng)殖密度壓力下，一旦感染某種病原，其他病原可趁機(jī)導(dǎo)致繼發(fā)感染，共同作用，導(dǎo)致發(fā)病羊群臨床癥狀表現(xiàn)較以往嚴(yán)重，藥物治愈率低下。

對(duì)此次成功分離的CpHV-1中國(guó)分離株JSHA1405的致病性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：JSHA1405分離株可導(dǎo)致山羊急性發(fā)熱，并持續(xù)一周以上，這與國(guó)外的研究結(jié)果[20]一致。攻毒組山羊在攻毒后出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，且可通過鼻腔/糞便排毒。與國(guó)外研究相比，本研究第一次發(fā)現(xiàn)可以從肛拭子中檢測(cè)到排毒。攻毒組山羊在攻毒后能夠產(chǎn)生中和抗體，抗體效價(jià)最高可達(dá)1 024，而國(guó)外類似的研究中攻毒組山羊的中和抗體效價(jià)最高為64[20]，這可能與不同毒株間毒力差異有關(guān)(國(guó)外研究中的研究對(duì)象為從潛伏感染山羊中分離到的毒株)。

這是首次檢測(cè)到CpHV-1在我國(guó)的存在，隨后本實(shí)驗(yàn)室又分別于2014年和2015年從省內(nèi)另外兩個(gè)山羊養(yǎng)殖場(chǎng)的育肥羊群檢測(cè)到該病原的存在并分離到病毒(NJ1401和HA1501)，gB基因相似性大于99%(數(shù)據(jù)略)。這表明該病毒在國(guó)內(nèi)羊群中具有一定的流行率?；诖耍緢F(tuán)隊(duì)先后建立了熒光定量PCR檢測(cè)方法和ELISA檢測(cè)方法，正在對(duì)不同年齡段、不同性別羊群中CpHV-1的流行分布情況進(jìn)行系統(tǒng)研究。

4 結(jié) 論

首次從國(guó)內(nèi)具有呼吸道癥狀的發(fā)病羊中分離并鑒定山羊皰疹病毒Ⅰ型，經(jīng)對(duì)其gB基因測(cè)序，病毒形態(tài)學(xué)鑒定和致病性試驗(yàn)證實(shí)分離到病毒，命名為JSHA1405。該研究為進(jìn)一步預(yù)防和控制山羊皰疹病毒Ⅰ型感染的發(fā)生和流行提供了基礎(chǔ)。