TGF-β1信號通路在副豬嗜血桿菌侵入3D4/21細胞中的作用

沈懿娟，周妮妮，張健淞，王美芬，李玉峰，姜 平

(南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院農業(yè)部細菌學重點開放實驗室，南京 210095)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,H.parasuis) 屬于巴氏桿菌科的一種革蘭陰性多形性桿菌，是Gl?sser病的病原體，主要引起豬的多種漿膜炎，如多發(fā)性關節(jié)炎和腦膜炎[1]。迄今為止，除了不可分型株外，已經鑒定了15種副豬嗜血桿菌血清型[2]。其中，1、5、10、12、13和14是強毒血清型，2、4、8和15是弱毒血清型，3、6、7、9和11被認為是無毒血清型[3]。通過副豬嗜血桿菌不同血清型侵入豬主動脈內皮細胞AOC-45發(fā)現，血清型1、2、4和5侵入細胞水平顯著高于血清型7、9、10和13型。據此可推測，細菌的毒力可能與其吸附和侵入細胞的能力有關[4]。然而，毒力與吸附/侵入之間的關系尚不清楚。

早期的科學研究已經證實副豬嗜血桿菌可以感染豬肺泡巨噬細胞并與細菌的毒力存在一定的相關性[5]。肺泡巨噬細胞作為先天免疫反應的成員之一，參與機體對外源病原的清除[6]。副豬嗜血桿菌在上呼吸道最初定植之后，在豬感染的早期階段進入肺[7]，并能夠被肺泡巨噬細胞吞噬[5, 8]。3D4/21細胞作為豬肺泡巨噬細胞的一種傳代細胞系雖然對一些病原菌已失去部分或全部的吞噬能力，但仍能被細菌侵入和保留分泌細胞因子的功能[9]，因此，該細胞可以作為副豬嗜血桿菌的侵入模型。

TGF-β1是一種多功能細胞因子，調節(jié)廣泛的生理過程以及病理過程(例如細胞內鳥分枝桿菌復合物感染細胞等[10])。嗅鞘細胞(OECs)可以分泌抗炎細胞因子TGF-β1，通過整合素/MFG-E8信號通路增強OECs的吞噬活性[11]。甲型流感病毒(IAV)感染細胞后會導致細胞TGF-β1表達升高，同時纖連蛋白(Fn)與α5整合素的表達也隨之增加，從而導致了嚴重的細菌繼發(fā)感染。Fn是由膠原、纖維蛋白原、纖連蛋白和層黏連蛋白組成的細胞外基質之一。細胞外基質可以與整合素相互作用，而整合素是可以影響細胞吸附、遷移、增殖和分化的大分子復雜混合物[12]。此外，細胞外基質還可以識別微生物表面組分，例如與細菌細胞壁共價連接的黏性基質分子[13]，而這些黏附因子均受到TGF-β1的調控[14]。

副豬嗜血桿菌病是當前我國豬群常見的細菌繼發(fā)感染性疾病，故本研究期望通過副豬嗜血桿菌感染3D4/21細胞試驗揭示免疫細胞中TGF-β1表達與副豬嗜血桿菌感染的關系。本研究探討了豬肺泡巨噬細胞傳代細胞系3D4/21中TGF-β1調控Fn/α5整合素表達與副豬嗜血桿菌侵入的關系。

1 材料與方法

1.1 試劑

巨噬細胞無血清培養(yǎng)基(Macrophage-SFM)購自賽默飛世爾科技公司；Mouse/Rat/Porcine/Canine TGF-β1 ELISA試劑盒購自安迪生物科技有限公司；Anti-Fibronectin購自艾博抗貿易有限公司；Purified Mouse Anti-Human CD49e 購自BD 生物科技公司；Alexa Fluor488結合的Affinipure山羊抗小鼠IgG購自Proteintech生物公司。特定的小干擾RNA(siRNA)片段由吉瑪生物公司合成。

1.2 細菌菌株和培養(yǎng)條件

本研究中使用副豬嗜血桿菌血清標準型5型菌株。將細菌在胰蛋白胨大豆瓊脂和含有0.01%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和5%滅活牛血清的胰酪胨大豆肉湯(分別為TSA和TSB； OXOID)中37 ℃培養(yǎng)。在使用之前，細菌接種于TSB并在37 ℃搖床以200 r·min-1振蕩過夜培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)物按1∶100接種新鮮培養(yǎng)基，振蕩孵育直至OD600 nm≈0.6。

1.3 3D4/21細胞培養(yǎng)

將3D4/21細胞在37 ℃ 5% CO2的條件下培養(yǎng)，并用含有10%滅活胎牛血清(FBS，Invitrogen)，100 U·mL-1青霉素G(Invitrogen)，100 mg·mL-1鏈霉素(Invitrogen)和MEM非必需氨基酸(Invitrogen)的RPMI 1640(Invitrogen)進行細胞培養(yǎng)。細胞在達到90%密度時進行傳代。

1.4 吸附和侵入試驗

按照已有實驗方法修改[15]后進行吸附和侵入試驗。將3D4/21細胞(3×105個細胞·孔-1)接種24孔細胞板。感染前，每個孔用PBS洗滌去除抗生素，并用副豬嗜血桿菌以幾個感染劑量(10、100、200和400 MOI)感染。將細胞板以800×g離心10 min，并在37 ℃ 5% CO2的溫箱中孵育不同時間(吸附：0.5、1、2 h，或侵入：1、2、4 h)。用PBS洗滌5次除去非特異性附著的細菌。

在進行吸附試驗時，除去非特異性附著的細菌后，在細胞板中加入100 μL 0.025%胰蛋白酶，37 ℃ 孵育10 min。胰蛋白酶處理后刮取細胞，轉移到無菌離心管中，然后以12 000×g離心1 min。除去上清液，將沉淀重懸于等體積的PBS中。將重懸的液體連續(xù)稀釋，取100 μL不同濃度稀釋液在TSA平板上涂布均勻。平板在37 ℃孵育48 h后進行細菌菌落計數。

在進行侵襲試驗時，除去非特異性附著的細菌后向每個細胞孔中加入完全生長培養(yǎng)基(包括100 U·mL-1青霉素G和0.25 mg·mL-1慶大霉素)，將細胞板孵育1 h以殺死細胞外副豬嗜血桿菌。將細胞板洗滌3次，如上所述收集細胞進行涂板。

1.5 熒光定量PCR分析

應用OMEGA公司的總RNA提取試劑盒分離細胞總RNA，應用HiScript Q RT SuperMix(諾唯贊生物公司)從總RNA合成cDNA，應用ABI 7300熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied 生物公司)進行熒光定量PCR。使用2-△△Ct方法以β-actin作為內參計算TGF-β1 mRNA相對表達量[16]。TGF-β1序列從Sus_scrofa基因組(GenBank登錄號：397078)中獲得，參照該基因序列設計相關TGF-β1引物(引物購自賽默飛世爾科技公司)(F: 5′-CGAGCCCTGGATACCAACTA-3′；R: 5′-AGGCTCCAGATGTAGGGACA-3′)建立SYBR-Green熒光定量PCR方法。

1.6 TGF-β1濃度測定

將3D4/21細胞(3×105個細胞·孔-1)接種到24孔細胞板中并在巨噬細胞無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用優(yōu)化后的侵入條件應用副豬嗜血桿菌感染，在12、24、36 h收集細胞上清液(每12 h收集上清液后，加入新培養(yǎng)基)并于-70 ℃保存。通過Mouse/Rat/Porcine/Canine TGF-β1 ELISA試劑盒測定上清液中TGF-β1的濃度，應用標準曲線(根據說明書計算)對上清中的TGF-β1進行定量。

1.7 RNA干擾測定

靶向Fn和α5整合素的siRNA片段以及一個非特異性隨機片段由吉瑪生物公司合成。siRNA序列來自于本實驗室前期研究[17]，將3D4/21細胞(6×105細胞·孔-1)接種到12孔細胞板中。當細胞密度達到約70%時，將其用Fn和α5整合素的siRNA片段(1.2 μg·孔-1)轉染。然后用胰蛋白酶消化細胞并通過流式細胞術分析。

1.8 流式細胞術分析

將3D4/21細胞用胰蛋白酶消化，并在37 ℃與Fn和α5整合素特異性抗體孵育0.5 h。用PBS洗滌細胞沉淀2次后將細胞重懸，并與Alexa Fluor 488-結合的Affinipure山羊抗小鼠IgG在37 ℃孵育0.5 h。用PBS洗滌細胞后重懸，然后進行流式細胞術分析。

2 結 果

2.1 副豬嗜血桿菌吸附和侵入條件的優(yōu)化

吸附和侵入試驗(CFU計數結果)表明最佳吸附條件為400 MOI作用0.5 h。最佳侵入條件為200 MOI作用2 h(圖1)。

2.2 副豬嗜血菌感染提高TGF-β1的表達

在副豬嗜血桿菌感染的細胞中TGF-β1水平在12、24和36 h分別是未感染細胞的1.36、1.52和1.25倍(P<0.05)(圖2A)。這些數據表明副豬嗜血桿菌感染增加了TGF-β1的表達。與此結果相一致的是熒光定量PCR也顯示副豬嗜血桿菌感染增強了TGF-β1 mRNA的表達，且在36 h觀察到最高值(P<0.001)(圖2B)。

2.3 TGF-β1提高副豬嗜血桿菌侵入

為了證實TGF-β1在侵入中的作用，將重組TGF-β1預處理細胞24 h后用副豬嗜血桿菌感染。結果顯示TGF-β1可以顯著增加副豬嗜血桿菌對3D4/21細胞的侵入(P<0.05)(圖3)。

2.4 副豬嗜血桿菌和TGF-β1可增加3D4/21細胞α5整合素和Fn的表達

用副豬嗜血桿菌感染3D4/21細胞和用重組TGF-β1處理24 h后，用流式細胞儀分析Fn和α5整合素的表達。與對照組相比，TGF-β1處理增加了Fn(7.77%對9.85%)和α5整合素(91.0%對97.8%)的表達。重要的是，副豬嗜血桿菌感染也增加了Fn(7.77%對9.11%)和α5整合素(91.0%對93.1%)的表達(圖4)。

單因素方差分析，Dunnett多重比較檢驗, ***.P<0.001, *.P<0.05One-way ANOVA, Dunnett’s multiple comparison test, ***.P<0.001, *.P<0.05圖1 副豬嗜血桿菌吸附和侵入條件的優(yōu)化Fig.1 Optimized conditions for H. parasuis adherence and invasion

A圖：配對t檢驗, *.P<0.05；B圖：單因素方差分析，Dunnett多重比較檢驗, ***.P<0.001Fig.A: Paired t test, *.P<0.05; Fig.B:One-way ANOVA, Dunnett’s multiple comparison test, ***.P<0.001圖2 副豬嗜血菌感染提高TGF-β1的表達Fig.2 H. parasuis infection enhances the expression of TGF-β1 in 3D4/21 cells

2.5 Fn和α5整合素的表達促進了3D4/21細胞的侵入

為了進一步分析Fn和α5整合素的作用，應用RNA干擾片段下調它們的表達水平。將siRNA干擾片段轉染3D4/21細胞后，顯著抑制Fn(7.66%vs4.49%)和α5整合素(12.3%vs5.48%)的表達(圖5)。

當用靶向α5整合素的siRNA片段轉染3D4/21細胞時，副豬嗜血桿菌的吸附和侵入分別下降了8.3%和37.4%。當用靶向Fn的siRNA轉染細胞時，副豬嗜血桿菌的吸附沒有降低，而侵入降低了15.9%(圖6)。

3 討 論

副豬嗜血桿菌可與上皮細胞和內皮細胞相互作用[17-19]。雖然巨噬細胞是抵御侵入病原體的第一道重要防線，但它們在副豬嗜血桿菌感染中的作用尚不清楚[20]。細菌對宿主細胞的吸附是定植和侵入細胞的重要步驟[20]，而且侵入與副豬嗜血桿菌的毒力有關[21]。我們的研究結果顯示，副豬嗜血桿菌對3D4/21細胞的最佳吸附條件為400 MOI作用0.5 h，而最佳侵入條件為 200 MOI作用2 h。這些結果表明豬傳代肺泡巨噬細胞3D4/21細胞在體外能被副豬嗜血桿菌感染，而且初步證明3D4/21細胞在12 h可以完全將侵入其中的副豬嗜血桿菌清除(數據未提供)，故3D4/21細胞可以用作研究H.parasuis侵入細胞的模型。

TGF-β1的表達與多種疾病和繼發(fā)感染相關。在研究Group AStreptococcus(GAS)感染上皮細胞中發(fā)現GAS誘導TGF-β1的產生，而TGF-β1上調Fn/α5整合素增強了GAS對上皮細胞的侵入[14]。

配對t檢驗, *.P<0.05Paired t test, *.P<0.05圖3 TGF-β1預處理3D4/21細胞后促進了副豬嗜血桿菌的侵入Fig.3 Pretreatment of 3D4/21 cells with recombinant TGF-β1 increased the invasion of Haemophilus parasuis

圖4 副豬嗜血桿菌感染和TGF-β1處理可增加3D4/21細胞Fn和α5整合素的表達Fig.4 H. parasuis infection and TGF-β1 treatment increase expression of Fn and α5 integrin

圖5 siRNA干擾Fn和α5整合素的表達水平Fig.5 Expression of Fn and α5 integrin after RNA silencing

單因素方差分析，Dunnett多重比較檢驗, ***.P<0.001, **.P<0.01, *.P<0.05One-way ANOVA, Dunnett’s multiple comparison test, ***.P<0.001, **.P<0.01, *.P<0.05圖6 Fn和α5抑制副豬嗜血桿菌的侵入Fig.6 Expression of α5 integrin and Fn inhibits invasion by H. parasuis

TGF-β1的表達與IAV感染后引起細菌繼發(fā)感染也相關[22]。在我們的研究中，副豬嗜血桿菌感染能顯著提高TGF-β1的表達，并在36 h達到高峰，而用TGF-β1預處理3D4/21細胞顯著增加副豬嗜血桿菌的侵入。流式細胞結果證實H.parasuis感染和TGF-β1處理可以上調Fn/α5整合素表達，由此我們推測H.parasuis感染3D4/21細胞誘導TGF-β1產生，且TGF-β1上調Fn/α5整合素表達會顯著增強H.parasuis對3D4/21細胞的侵入。

為進一步驗證Fn和α5整合素與H.parasuis侵入的相關性。應用針對α5和Fn的siRNA片段下調Fn和α5的表達，揭示Fn和α5整合素的表達水平與3D4/21細胞對副豬嗜血桿菌的侵入呈正相關，證實了TGF-β1表達可以調控副豬嗜血桿菌的侵入。然而，副豬嗜血桿菌對細胞的吸附與α5表達相關，但與Fn關聯較小。我們推測副豬嗜血桿菌吸附可能與除Fn以外的細胞外基質相關，該推測需要進一步試驗驗證。

H.parasuis對3D4/21細胞的侵入水平可能會影響機體的抵抗力，細菌侵入細胞后細菌和細胞的相互作用仍需要進一步研究。H.parasuis感染后TGF-β1表達的增加提高了其對3D4/21細胞的侵入，有可能提高機體對細菌的清除水平，這可能是機體維持自身平衡的一個精巧調節(jié)機制。

4 結 論

TGF-β1和Fn/α5整合素的表達促進了副豬嗜血桿菌對3D4/21細胞的侵入，并在此過程中發(fā)揮重要作用。