IgA腎病大鼠尿維生素D結(jié)合蛋白與腎臟纖維化關(guān)系的研究*

何國華，容麗萍，姜夢婕，蔣小云

（1.廣東省佛山市婦幼保健院 兒科，廣東 佛山 528000；2.中山大學附屬第一醫(yī)院 兒科，廣東 廣州 510089）

IgA腎病是全球最常見的原發(fā)性腎小球疾病之一[1]。在成人患者，每10年約有20%的患者進展至終末期腎?。╡nd stage renal disease,ESRD）[2]。IgA腎病進展至ESRD的危險因素包括蛋白尿、高血壓、腎功能不全、新月體形成、腎小球系膜細胞重度增生、腎小球硬化、腎小管纖維化等[1]。對IgA腎病小管間質(zhì)纖維化，目前缺乏早期的、有效的、無創(chuàng)的指標。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smads信號通路是包括腎臟在內(nèi)的多種組織纖維化的最主要通路之一，在IgA腎病患者腎組織中，TGF-β1表達與腎小管損傷及間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)[3]。

維生素D結(jié)合蛋白（vitamin D binding protein,VDBP）分子量為5.8 kD，是血漿中維生素D及其代謝產(chǎn)物的主要轉(zhuǎn)運蛋白[4]。VDBP在肝臟合成，在腎小球被濾過，在近曲小管由受體介導重吸收[5]。當腎小管受損傷時，VDBP重吸收功能降低，在慶大霉素造成的腎炎大鼠模型中的研究發(fā)現(xiàn)，尿VDBP能夠作為腎小管間質(zhì)損傷的一個生物學標記，并且獨立于蛋白尿的存在[6]，該發(fā)現(xiàn)提示尿VDBP可以作為一個無創(chuàng)性的尿液標志，用于監(jiān)測小管間質(zhì)纖維化。

本研究運用改良的牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）+脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）+四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）方法復制實驗性IgA腎病大鼠模型[3]，研究尿VDBP在IgA腎病腎小管間質(zhì)纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型的復制及分組

健康清潔級5周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠采購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，共20只，體重120～140 g，隨機分為對照組，模型組，每組10只。其中模型組運用改良的BSA+LPS+CCl4方法復制實驗性IgA腎病大鼠模型[3]。具體方案：將免疫原BSA以蒸餾水配成10%濃度，隔天灌胃400 mg/kg，持續(xù)8周；皮下注射蓖麻油0.3 ml+CCl40.1 ml，每周1次，持續(xù)9周；LPS以生理鹽水配成0.025%濃度，于實驗第6周尾靜脈注射0.05 mg。同時對照組大鼠給予蒸餾水灌胃，生理鹽水皮下注射及尾靜脈注射。所有大鼠在實驗期間均予標準飲食。在實驗第10周末收集尿標本后處死大鼠收集血標本、腎組織標本進行下述測量。

1.2 尿蛋白、尿紅細胞及尿VDBP的測量

在實驗第10周末使用代謝籠留取大鼠24 h尿，進行尿紅細胞鏡檢，并分別記錄尿量，測定24 h尿蛋白。通過酶聯(lián)免疫吸附法（維生素D結(jié)合蛋ELISA試劑盒，美國Alpco公司）測定尿VDBP含量。

1.3 血生化檢測

在實驗第10周末，處死大鼠，予10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，心臟取血，用全自動生化分析儀測定血中生化指標，包括：尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）。

1.4 腎臟病理檢查

大鼠處死后取約0.2 cm厚度矢狀面切片，置于10%甲醛固定，48 h內(nèi)行石蠟包埋，用于光鏡檢查及免疫熒光IgA檢查。IgA免疫熒光強度判定，根據(jù)目前國內(nèi)外通用標準，參照5級半定量法分為-～++++5個等級。①-：低倍鏡下不能顯示、高倍鏡下似乎可見；②+：低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下可見；③++：低倍鏡下可見，高倍鏡下清晰可見；④+++：低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼；⑤++++：高倍鏡下刺眼。使用Masson三色染色評估腎臟組織纖維化程度[7]，膠原纖維呈藍色，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行半定量分析，以膠原纖維在腎組織含量的百分比表示腎臟組織的纖維化程度。

1.5 TGF-β1蛋白表達的檢測

采用Western blot法檢測。將樣品組織研成粉末，加入裂解液提取總蛋白，BCA法測定計算蛋白質(zhì)濃度。取相同質(zhì)量的蛋白質(zhì)變性，上樣，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。封閉液封閉120 min，后置于一抗孵育，反應時間90 min，洗膜，二抗孵育60 min，洗膜，用化學發(fā)光置于暗夾內(nèi)曝光、依次顯影、定影。將膠片進行掃描，應用Quantity One圖像分析軟件對凝膠圖像條帶進行分析，計算目標條帶的凈光密度值。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，相關(guān)性分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟病理結(jié)果

對照組大鼠腎小球無明顯IgA沉積，熒光強度-～±（見圖1A、B），模型組腎小球系膜區(qū)均可見團塊狀或顆粒狀綠色IgA熒光，熒光強度++～+++（見圖1C、D），提示IgA腎病大鼠模型復制成功。

2.2 血生化檢測結(jié)果

兩組BUN、Scr、TP、ALB水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 1。

2.3 各組24 h尿蛋白、尿紅細胞、尿VDBP的變化

模型組24 h尿蛋白、尿紅細胞、24 h尿VDBP高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2。

2.4 各組腎纖維化及TGF-β1蛋白表達水平的變化

在Masson染色病理改變上，對照組腎小球、腎小管及間質(zhì)組織病理形態(tài)無異常，系膜區(qū)基質(zhì)及細胞未見增加，腎小管、腎間質(zhì)、血管無明顯病變，腎組織鮮有藍色膠原纖維著色區(qū)域（見圖2A）。模型組Masson染色見系膜區(qū)中到重度不同程度細胞及基質(zhì)增生，部分腎小球基底膜、系膜區(qū)見藍色線條狀區(qū)域，在腎間質(zhì)小管處可見斑塊條狀藍色區(qū)域散在分布，血管膠原纖維也呈藍色著色（見圖2B）。

模型組膠原纖維含量[（13.80±6.18）%]高于對照組 [（1.23±1.07）%]差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

模型組腎組織TGF-β1蛋白表達水平（1.03±0.14），高于對照組（0.61±0.14），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.5 相關(guān)性分析

所有大鼠24 h尿VDBP與尿蛋白呈正相關(guān)（r=0.859，P=0.000），與腎纖維化呈正相關(guān)（r=0.908，P=0.000），與TGF-β1蛋白表達呈正相關(guān)（r=0.859，P= 0.009）。見表3和圖3。

圖1 兩組大鼠腎臟病理學改變 （免疫熒光）

表1 兩組血生化檢測結(jié)果 （n =10，±s）

表1 兩組血生化檢測結(jié)果 （n =10，±s）

ALB/（g/L）對照組 8.07±0.76 39.28±4.33 60.53±3.20 25.97±1.83模型組 7.41±1.03 39.46±5.36 59.47±3.18 26.36±1.08 t值 1.625 -0.083 0.743 -0.580 P值 0.122 0.935 0.467 0.570組別 BUN/（μmol/L）Scr/（mmol/L）TP/（g/L）

圖2 兩組大鼠腎臟染色結(jié)果 （Masson×100）

表2 兩組尿蛋白、尿紅細胞、尿VDBP、膠原纖維、腎組織TGF-β1蛋白表達水平的比較 （n =10，±s）

表2 兩組尿蛋白、尿紅細胞、尿VDBP、膠原纖維、腎組織TGF-β1蛋白表達水平的比較 （n =10，±s）

組別 尿蛋白/（mg/24 h） 尿RBC/（個/Hp） 尿VDBP/（μg/24 h） 膠原纖維/% TGF-β1對照組 5.40±1.50 4.50±2.64 0.19±0.09 1.23±1.07 0.61±0.14模型組 23.44±2.72 158.20±86.38 0.65±0.27 13.80±6.18 1.03±0.14 t值 -18.360 -5.624 -5.154 -6.330 -6.500 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 尿蛋白、尿VDBP與腎臟纖維化的相關(guān)性

表3 尿VDBP分別與尿蛋白、腎纖維化、TGF-β1蛋白表達的相關(guān)分析

3 討論

IgA腎病的臨床表現(xiàn)多樣，輕重程度不一，從無癥狀的尿檢異常到急性腎衰竭均可出現(xiàn)。IgA腎病病理改變多種多樣，但時常有不同程度的腎間質(zhì)病變，研究發(fā)現(xiàn)，小管間質(zhì)受累程度影響到腎小球病變的轉(zhuǎn)歸[8-9]。在IgA腎病患者中，部分腎小球病變嚴重，但間質(zhì)病變輕微的患者長期預后較好，而間質(zhì)損害嚴重，小球病變輕微的病例長期隨訪預后不佳，提示腎臟間質(zhì)纖維化是預測IgA腎病病情預后的重要指標[10]。

VDBP為簇特異性蛋白（group-specific component,Gc）分子量為5.8 kD，在體內(nèi)有多重作用，包括轉(zhuǎn)運維生素D，調(diào)控體內(nèi)炎癥反應以及免疫調(diào)節(jié)等作用[11]。VDBP在肝臟合成，經(jīng)過腎小球濾過，在近曲小管重吸收[5]，因此，尿中的VDBP水平很大程度取決于腎小管的重吸收功能。當腎小管間質(zhì)出現(xiàn)纖維化改變時，可以導致尿VDBP重吸收減少，從而使尿中VDBP升高[6，12]，上述研究為檢測尿VDBP水平反應小管間質(zhì)損傷提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，IgA腎病模型組尿VDBP高于對照組。既往其他動物模型及腎病患者研究中，亦發(fā)現(xiàn)腎損傷時尿VDBP水平升高：在阿霉素大鼠模型中，尿VDBP在腎損傷早期即出現(xiàn)升高，與小管間質(zhì)纖維化的指標密切相關(guān)[6]，并且獨立于白蛋白尿[6]。在大鼠尿毒癥模型中，發(fā)現(xiàn)從尿中丟失VDBP增多[13]。而在糖尿病腎病患者的研究中發(fā)現(xiàn)，尿VDBP排出量增加[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)，模型組尿VDBP定量高于對照組，說明在IgA腎病在腎損傷時會出現(xiàn)尿VDBP定量升高。

TGF-β1/Smad3信號通路在腎小球硬化、腎小管損傷和腎間質(zhì)纖維化過程起其重要的作用。TGF-β1與具有絲氨酸-蘇氨酸活性的細胞的表面受體過特異性結(jié)合，并激活該受體，啟動免疫應答，作用于相應的靶基因，如纖連蛋白（fibronectin,FN），調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄、表達。FN表達水平上調(diào)意味著細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix,ECM）積聚，最終會出現(xiàn)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[15]。在IgA腎病患者腎組織中，TGF-β1表達與FN表達呈正相關(guān)，并且與腎小管損傷及間質(zhì)纖維化呈正相關(guān)[15]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，24 h尿VDBP水平與腎臟纖維化程度以及TGF-β1蛋白的表達呈正相關(guān)，提示尿VDBP可以反映腎臟纖維化程度，并隨著腎損傷的嚴重程度而增加。尿VDBP水平與腎小管細胞巨噬細胞浸潤程度以及膠原纖維表達呈正相關(guān)，并與多種小管損傷因子呈正相關(guān)[6]。CKD患者中研究發(fā)現(xiàn)，尿VDBP隨疾病的嚴重程度而增加[16-17]。提示尿VDBP可能涉及腎臟纖維化過程中多種系統(tǒng)免疫調(diào)控，但尚有待進一步研究證實。

本研究發(fā)現(xiàn)，在IgA腎病模型中，24 h尿VDBP與24 h尿蛋白呈正相關(guān)。在阿霉素大鼠模型研究中，尿VDBP在腎損傷早期升高，并且獨立于白蛋白尿，提示尿VDBP在尿蛋白出現(xiàn)改變之前即可發(fā)生改變，反應腎損傷的程度[6]。本實驗研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的尿蛋白及尿VDBP水平高于對照組，尿VDBP組間的差異與腎臟纖維化程度及在腎組織纖維化的程度改變一致，提示與尿蛋白相似，尿VDBP能反應腎組織纖維化的程度。在CKD患者的一項研究中發(fā)現(xiàn)，尿VDBP在CKD患者中升高，并且與蛋白尿水平呈正相關(guān)[18]，其研究結(jié)果與本實驗研究發(fā)現(xiàn)一致。推測其原因，無論是阿霉素腎病大鼠、IgA腎病大鼠、CKD患者，其蛋白尿成分主要為白蛋白，白蛋白分子量為6.85 kD，分子量比VDBP大。白蛋白主要經(jīng)過腎小球濾過，在腎小球濾過屏障損傷時，尿中白蛋白升高，是尿蛋白的主來源。尿蛋白水平是公認的反應腎小球濾過屏障損傷的指標，而前述研究中提到，尿VDBP是在腎小管被重吸收，尿中VDBP水平反應腎小管損傷及間質(zhì)纖維化程度的指標。故從反映腎纖維化角度出發(fā)，尿VDBP可能是比尿蛋白更敏感、準確的指標。提示尿VDBP可以作為一個無創(chuàng)性的尿液標志，用于早期監(jiān)測小管間質(zhì)炎癥和纖維化。在不同的腎臟疾病中，尿VDBP水平與尿蛋白水平是否存在相關(guān)性該問題，值得進一步探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，IgA腎病大鼠尿VDBP升高，尿VDBP與腎纖維化、尿蛋白呈正相關(guān)，尿VDBP可作為監(jiān)測IgA腎病大鼠腎纖維化的一個無創(chuàng)的生物學指標。