三七葉、三七花質(zhì)量標準研究△

趙振霞，王敏，段吉平，劉永利*，莊愛愛

(1.河北省藥品檢驗研究院，石家莊 050011；2.河北科技大學(xué) 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，石家莊 050016)

三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen為五加科人參屬多年生草本植物，是我國重要的傳統(tǒng)中藥[1]，以干燥根及根莖入藥，傳統(tǒng)用于活血化瘀，跌打損傷，以及滋補強壯等?，F(xiàn)階段主要以三七的地下部分使用為主，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量的三七葉、三七花等未得到充分開發(fā)利用。三七葉、三七花具有一定的清涼、平肝等功效，傳統(tǒng)上作為茶飲料使用，現(xiàn)代研究表明對心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)均具有顯著作用[2-4]，三七葉和三七花已作為商品流通于醫(yī)藥市場。文獻報道三七葉、三七花主要含原人參二醇型皂苷，幾乎不含原人參三醇型皂苷，這是與三七主根含皂苷的主要不同點，含量較高的有人參皂苷Rb1、Rb3、Rc以及三七皂苷Fc等[5-7]。人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3為三七葉、三七花的藥理活性物質(zhì)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)等方面具有一定的藥理作用[8-11]。本文在相關(guān)文獻[12]測定基礎(chǔ)上，選擇人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3為檢測指標，對薄層鑒別及含量測定進行了系統(tǒng)研究，建立了三七葉、三七花的質(zhì)量標準。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(配備四元泵，UV檢測器，Waters e 2695，美國Waters公司)；AE240電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 材料

實驗用三七葉、三七花樣品來自產(chǎn)地云南、廣西及亳州、玉林、廉橋、高橋、安國等藥材市場，經(jīng)鑒定為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen 的干燥莖葉與干燥花序。對照品：人參皂苷Rb1(批號：110704-201424，含量以93.7%計)、人參皂苷Rb2(批號：111715-201203，含量以93.8%計)、人參皂苷Rb3(批號：111686-201504，含量以97.0%計)均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；三七莖葉皂苷(批號：1553-200201)購自中國食品藥品檢定研究院，供鑒別用；乙腈(色譜純，Merck，Germany)，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

取三七葉粉末0.6 g(或三七花粉末0.2 g)，加水1 mL，攪勻，再加水飽和的正丁醇15 mL，密塞，振搖10 min，放置30 min，離心，取上清液，加正丁醇飽和的水20 mL，搖勻，放置使分層，取正丁醇層蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。再取人參皂苷Rb3對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，取三七莖葉皂苷對照加甲醇制成每1 mL含3 mg的溶液作為對照溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：乙醇：水(2∶2∶1)10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別在日光和紫外光(365 nm)下檢視。三七葉供試品色譜中，在與人參皂苷Rb3對照品和三七莖葉皂苷對照提取物色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的斑點，紫外光下顯相同顏色的熒光斑點(圖1)；三七花供試品色譜中，在與人參皂苷Rb3對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的斑點，紫外光下顯相同顏色的熒光斑點(圖2)。

注：1.人參皂苷Rb3；2.三七莖葉皂苷；3.三七葉樣品；4.三七葉樣品；5.三七葉樣品。圖1 三七葉鑒別薄層色譜圖

注：1.人參皂苷Rb3 ；2.三七花樣品；3.三七花樣品；4.三七花樣品。圖2 三七花鑒別薄層色譜圖

2.2 水分測定

取三七葉和三七花樣品適量，粉碎，取粉末約2 g，精密稱定，平鋪于已恒重的稱量瓶中，按《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0832第二法測定，計算水分的百分含量。結(jié)果見表1、表2。

2.3 總灰分、酸不溶性灰分的測定

取三七葉和三七花樣品適量，粉碎，取粉末約3 g，精密稱定，置已恒重的坩堝中，按《中國藥典》2015年版四部通則2302測定總灰分與酸不溶性灰分。結(jié)果見表1、表2。

2.4 含量測定

2.4.1 混合對照品溶液的制備 取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2和人參皂苷Rb3對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rb160 μg、人參皂苷Rb260 μg、人參皂苷Rb3100 μg的混合溶液，即得。

2.4.2 供試品溶液的制備 三七葉：取本品粉末(過四號篩)0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，80 ℃水浴上保持微沸2小時，取出，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

三七花：取本品粉末(過四號篩)0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，置80 ℃水浴上保持微沸2小時，取出，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 色譜條件 色譜柱：Thermo C18(4.6×250 mm，5 μm)，流動相：以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫：0～20 min，A 10%→33%，20～50 min，A 保持33%。流速：1 mL·min-1，柱溫：30 ℃，檢測波長：203 nm，進樣量：10 μL。按上述色譜條件，各成分分離度良好，測定結(jié)果見圖3。

注：1.人參皂苷Rb1；2.人參皂苷Rb2；3.人參皂苷Rb3。圖3 對照品(A)及三七葉(B)、三七花(C)色譜圖

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取人參皂苷Rb1對照品溶液(濃度依次為：0.0142 2、0.071 1、0.142 2、0.284 4、0.853 4、1.422 4 mg·mL-1)10 μL，注入高效液相色譜儀；精密吸取人參皂苷Rb2對照品溶液(濃度依次為：0.037 74、0.075 48、0.151 0、0.563 8、0.845 8、1.409 6 mg·mL-1)10 μL，注入高效液相色譜儀；精密吸取人參皂苷Rb3對照品溶液(濃度依次為：0.021 82、0.109 1、0.218 2、0.436 4、0.872 6、1.454 4 mg·mL-1)10 μL，注入高效液相色譜儀。以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程。結(jié)果見表3。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在配制后0、2、6、10、16、24 h進樣分析，記錄峰面積積分值，計算RSD，結(jié)果三七葉、三七花中人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2和人參皂苷Rb3三種成分RSD均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 重復(fù)性試驗 取同一批樣品粉末(過四號篩)，三七葉取0.3、0.6、0.9 g各三份，三七花取0.1、0.2、0.3各三份，精密稱定，按“2.4.2”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件進樣分析，記錄各成分峰面積，計算含量及RSD，結(jié)果見表4，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的三七葉約0.3 g、三七花約0.1 g，每種樣品各6份，分別加入用80%甲醇配制的混合對照品溶液，按“2.4.2”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件進樣分析，計算各組分平均回收率及RSD值，結(jié)果見表5，表明該方法回收率較好。

2.4.8 樣品測定 采用所建立的方法對收集到的三七葉、三七花樣品進行3種皂苷類成分的含量測定，結(jié)果見表6、表7。

3 討論

三七的薄層鑒別標準中收載較多，但三七葉、三七花的薄層鑒別相關(guān)報道較少，本文以三七葉與三七花中特征性成分人參皂苷Rb3為對照，建立了三七葉、三七花的薄層鑒別方法，該方法簡便易行，我們對多個廠家生產(chǎn)的薄層板(青島海洋化工廠、煙臺信德化學(xué)有限公司、Merk公司)進行了考察，結(jié)果均能很好地分離，表明新建立方法有較好的耐用性。

含量測定比較了40%、60%、80%甲醇、甲醇等不同提取溶劑及不同提取方式(超聲和回流)和不同提取時間(0.5、1、1.5、2.0、2.5 h)對提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)采用80%甲醇回流提取2 h，3種皂苷類成分均可較完全的提取出來，方法簡便、易行。對制定方法進行了不同色譜柱、不同儀器以及柱溫、流速、流動相比例微小變化等色譜條件變化的耐用性考察，結(jié)果色譜峰均分離較好，測定結(jié)果基本一致，表明本方法耐用性較好。

三七葉和三七花的水分、總灰分、酸不溶性灰分和有效成分的含量是影響其質(zhì)量的主要指標，這些數(shù)據(jù)將為三七葉和三七花的質(zhì)量標準制定提供參考。

三七地上部分資源充足，現(xiàn)開發(fā)利用較少，因此對三七葉、三七花的質(zhì)量標準的研究，不僅為三七葉、三七花作為藥用資源的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持，而且對提高三七的綜合開發(fā)利用，增加三七的經(jīng)濟價值有重要意義。