不同商品規(guī)格決明子的質(zhì)量分析△

楊國(guó)靜，張珞琪，陳隨清，王利麗

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

決明子為豆科植物決明CassiaobtusifoliaL.或小決明CassiatoraL.的干燥成熟種子。具有清肝明目、潤(rùn)腸通便的作用[1]。研究表明決明子中的含有蒽醌類、萘并吡喃酮苷類脂肪酸類以及無(wú)機(jī)元素等，主要有效成分為蒽醌類[2-3]，且有研究表明萘并吡喃酮苷類的含量也不低。現(xiàn)代藥理研究表明決明子具有降脂、降壓、抗誘變以及保肝的作用[4-5]。近年來(lái)對(duì)決明子的質(zhì)量研究日益增多，如紀(jì)亞明[6]在不同產(chǎn)地決明子的有效成分含量差異與品質(zhì)評(píng)價(jià)中得出河南、安徽、四川區(qū)域決明子蒽醌含量較高；張毅等[7]在HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地決明子中蒽醌類成分得出不同產(chǎn)地間的7個(gè)蒽醌類成分差異較大?；炯性诋a(chǎn)地之間的對(duì)比，對(duì)決明規(guī)格之間的對(duì)比卻很少，并且近些年來(lái)大量進(jìn)口決明子從緬甸、越南、老撾等國(guó)流入國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，憑借低廉價(jià)格已占領(lǐng)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)半壁江山[8]，沖擊國(guó)產(chǎn)決明市場(chǎng)，造成市場(chǎng)品種混亂，質(zhì)量參差不齊。另一方面，決明的栽培技術(shù)粗放、良種選育滯后、缺乏資源保護(hù)措施等問(wèn)題制約決明子相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[9]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采集12份不同規(guī)格的進(jìn)口以及國(guó)產(chǎn)決明樣品，運(yùn)用薄層色譜法以及高效液相色譜法對(duì)決明子進(jìn)行質(zhì)量分析及差別比較，為確保市場(chǎng)規(guī)范化以及用藥質(zhì)量提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

4種不同規(guī)格決明樣品主要收集于不同藥材市場(chǎng)，經(jīng)我校陳隨清教授鑒定為豆科植物決明CassiaobtusifoliaL.或小決明CassiatoraL.的干燥成熟種子。詳情見(jiàn)表5。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

BSA124S-CW十萬(wàn)分之一分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)、BSA124S萬(wàn)分之一分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、Waters 2695高效液相色譜儀、Milli-Q型自動(dòng)雙重純水蒸餾器(鄭州中譜儀器設(shè)備有限公司)。

對(duì)照品：橙黃決明素(中國(guó)食品藥品檢定研究院，111900-201504)、決明子苷(成都昂賽思生物科技有限公司)、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、紅鐮霉素龍膽二糖苷(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別是T26O7F23603、P19A7F13264、P26M7F15364、T10M8Z31177)。乙腈、四氫呋喃為色譜純，其他為分析純，水為雙蒸水。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

國(guó)產(chǎn)決明與進(jìn)口決明無(wú)明顯差別，均為表面綠棕色或暗棕色，形狀為不規(guī)則的圓柱形，兩端一端平坦，另一端為為稍傾斜。大多決明子表面以及背面各有一條棱線，少數(shù)棱線不明顯，在棱線兩側(cè)有兩條的凹陷狀，凹陷平行對(duì)稱。質(zhì)地堅(jiān)硬，不易破碎。

國(guó)產(chǎn)小決明與進(jìn)口小決明也無(wú)明顯差別，均為圓柱形，較小，表面綠棕色或暗棕色，表面棱線兩側(cè)各有1片寬廣的淺黃棕色帶。質(zhì)堅(jiān)硬，不易破碎。

2.2 顯微鑒別

注：A.決明；B.小決明；1.草酸鈣簇晶；2.柵狀細(xì)胞；3.支柱細(xì)胞圖1 決明子粉末顯微圖

A為決明粉末，草酸鈣簇晶較少且小，直徑3～13 μm。柵狀細(xì)胞側(cè)壁不均勻加厚，直徑40～65 μm。支柱細(xì)胞側(cè)面觀呈啞鈴型，表面觀可見(jiàn)兩層同心圓。

B為小決明粉末，草酸鈣簇晶較多且大，直徑6～19 μm。柵狀細(xì)胞側(cè)壁不均勻加厚，直徑38～57 μm。支柱細(xì)胞側(cè)面觀呈啞鈴型或葫蘆型，表面觀有時(shí)可見(jiàn)兩層同心圓。

2.3 薄層鑒別

取12份樣品粉末各1 g，加甲醇10 mL，浸提1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，置水浴鍋上加熱30 min，立即冷卻，用乙醚提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。取橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品，加無(wú)水乙醇：乙酸乙酯(2∶1)制成每1 mL各含1 mg的混合對(duì)照溶液。分別吸取上述溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以石油醚(30℃～60℃)-丙酮(1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置氨蒸氣中熏后觀察。

注：a為混合標(biāo)品；1、6、11號(hào)為小決明(進(jìn)口)；3、4、7號(hào)為小決明；8、9、10號(hào)為決明；2、5、12號(hào)為決明(進(jìn)口)圖2 決明子薄層色譜圖

2.4 大黃酚、橙黃決明素含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18(4.6×150 mm，5 μm)，柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，0～20 min，40%乙腈；20～40 min，40%～60%乙腈；40～50 min，60%～90%乙腈。見(jiàn)圖3。

注：A.混合對(duì)照品；B.決明子樣品；1.橙黃決明素；2.大黃酚圖3 決明子樣品與對(duì)照品的液相色譜圖

2.4.2 供試品溶液的制備 取各個(gè)樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，加稀鹽酸30 mL，置水浴中加熱水解1 h，立即冷卻，用三氯甲烷振搖提取4次，每次30 mL。合并三氯甲烷，回收溶劑至干，用乙酸乙酯-無(wú)水乙醇(1：2)溶解轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，既得。

2.4.3 混合對(duì)照品的制備 取大黃酚與橙黃決明素對(duì)照品適量，精密稱定，加無(wú)水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)制成質(zhì)量濃度分別為0.033、0.022 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述2.4.2項(xiàng)下混合對(duì)照品2、4、8、10、16 μL，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得橙黃決明素回歸方程為Y=8 272.2X-177.21(r=0.999 6)，線性范圍是0.04～0.35 μg，得大黃酚回歸方程為Y=1 991.4X+2.42(r=0.999 9)，線性范圍是0.07～0.53 μg。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算橙黃決明素和大黃酚的峰面積RSD分別為0.96%，0.84%，表明儀器的精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一供試品溶液，分別于0、4、6、8、12、24 h按2.4.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，計(jì)算橙黃決明素和大黃酚的峰面積RSD分別為1.85%，1.14%，表示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6份，按2.4.2項(xiàng)下方法制備，分別吸取10 μL，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算橙黃決明素和大黃酚的峰面積RSD分別為1.66%，1.17%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定同一批號(hào)已知含量的粉末約0.25 g，6份，置錐形瓶中，于每份樣品中精密加入適量橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品，按2.4.2項(xiàng)下方法制備，分別吸取10 μL，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算橙黃決明素和大黃酚的平均回收率分別為97.10%，98.22%，RSD值分別是1.12%，1.48%，結(jié)果見(jiàn)表1，表2。

2.4.9 含量測(cè)定 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液與12份供試品溶液10 μL，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.5 紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱為Waters symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈-四氫呋喃-1%冰醋酸(17∶2∶81)，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。

注：A.混合對(duì)照品；B.決明子樣品；1.紅鐮霉素龍膽二糖苷；2.決明子苷?qǐng)D4 決明子樣品與對(duì)照品的液相色譜圖

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷適量，精密稱定，加甲醇溶解，配置成濃度分別為0.27、0.23 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取各個(gè)樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取25 mL，蒸干，用甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中，備用。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述2.5.2項(xiàng)下混合對(duì)照品2、4、6、8、10 μL，按2.4.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得紅鐮霉素龍膽二糖苷回歸方程為Y=3 387 151X-301 731(r=0.999 8)，線性范圍是0.5～5.45 μg，決明子苷回歸方程為Y=2 354 587X-241 825(r=0.999 5)，線性范圍是0.46～4.6 μg。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.5.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算紅鐮霉素龍膽二糖苷和決明子苷的峰面積RSD分別為0.74%，0.57%，表明儀器的精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一供試品溶液，分別于0、4、6、8、12、24 h按2.5.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，計(jì)算紅鐮霉素龍膽二糖苷和決明子苷的峰面積RSD分別為1.12%，表示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6份，按2.4.2.3項(xiàng)下方法制備，分別吸取10 μL，按2.4.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算紅鐮霉素龍膽二糖苷和決明子苷的峰面積RSD分別為1.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定同一批號(hào)已知含量的粉末約0.25 g，6份，置錐形瓶中，于每份樣品中精密加入適量紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷對(duì)照品，按2.5.3項(xiàng)下方法制備，分別吸取10 μL，按2.5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算橙黃決明素和大黃酚的平均回收率分別為99.29%、99.21%，RSD值分別是2.51%、1.81%，結(jié)果見(jiàn)表3，表4。

2.5.9 含量測(cè)定 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液與12份供試品溶液10 μL，按2.5.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算其各個(gè)成分含量。對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行方差分析以及用字母進(jìn)行顯著性標(biāo)記。字母標(biāo)記法是含有相同字母之間無(wú)差異，含不同字母之間具有顯著性，小寫字母表示顯著性，大寫字母表示極顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

表5 決明有效成分含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

表5續(xù)

表6 決明子有效成分含量測(cè)定分析結(jié)果

注：小字母表示具有顯著性差異(P<0.05)；大寫字母表示具有極顯著性差異(P<0.01)。

3 結(jié)果與討論

通過(guò)顯微(圖1)可以看出決明與小決明中都含有草酸鈣簇晶、柵狀細(xì)胞以及支柱細(xì)胞。其中決明中的草酸鈣簇晶較小決明的小，柵狀細(xì)胞的直徑較小決明大。而小決明的支柱細(xì)胞側(cè)面觀較決明多了啞鈴型。從顯微可以看出決明與小決明有一定區(qū)別。

薄層色譜圖(圖2)中亮黃色斑點(diǎn)為橙黃決明素，粉紅色斑點(diǎn)為大黃酚。不同規(guī)格決明子中都含有橙黃決明素和大黃酚，并且可以看出4、8、12號(hào)在橙黃決明素標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的位置上斑點(diǎn)較明顯，可能其含量較高，而1、2、5、6、11號(hào)相應(yīng)位置斑點(diǎn)不明顯，可能其含量較低。但大黃酚相應(yīng)位置斑點(diǎn)明顯程度相差不大。含量測(cè)定將進(jìn)一步確定其高低。

從方差分析(表6)結(jié)果可以看出在4個(gè)不同規(guī)格決明子之間，橙黃決明素與大黃酚兩個(gè)成分之間無(wú)明顯差別，紅鐮霉素龍膽二糖苷和決明子苷兩個(gè)成分之間有顯著差別，從表5中的平均值看，決明的橙黃決明素、大黃酚、紅鐮霉素龍膽二糖苷以及決明子苷的含量要高于其它規(guī)格決明子且符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。其次為小決明、決明(進(jìn)口)，小決明(進(jìn)口)含量最低。然而小決明(進(jìn)口)的決明子苷要高于小決明。由于決明子苷不是決明子的指標(biāo)性成分，需進(jìn)一步研究。

從表6中的平均值看，決明的橙黃決明素和大黃酚的含量要高于小決明且符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，可能與種植環(huán)境有關(guān)。決明喜溫暖濕潤(rùn)氣候，陽(yáng)光充足有利于其生長(zhǎng)，不耐旱，土壤以排水良好、肥沃疏松為佳，陰坡地、低洼地生長(zhǎng)不良[10]?，F(xiàn)今決明人工種植廣泛，而小決明野生居多，野生環(huán)境可能造成其生長(zhǎng)不良，導(dǎo)致其含量較低。從表1中可以得出大部分進(jìn)口決明的橙黃決明素和大黃酚2個(gè)有效成分的含量均低于藥典標(biāo)準(zhǔn)，可能是由于進(jìn)口決明在國(guó)外一年種兩季，生長(zhǎng)期較短導(dǎo)致含量降低[7]。不能代替國(guó)產(chǎn)決明作為藥用。這與閆婕等[11]HPLC測(cè)定全國(guó)不同產(chǎn)地及進(jìn)口決明子大黃酚與橙黃決明素含量的結(jié)果相類似，發(fā)現(xiàn)國(guó)產(chǎn)決明的質(zhì)量?jī)?yōu)于進(jìn)口決明。這為決明子的開(kāi)發(fā)利用以及綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。