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    飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖模型中胃食管黏膜的變化研究

    2018-09-01 08:17:18買(mǎi)買(mǎi)提依斯熱依力艾克拜爾艾力吾布力卡斯木吾拉木伊比提哈爾買(mǎi)買(mǎi)提艾力巴突爾艾克木王儉艾熱夏提吐洪江曹正一阿布拉江米吉提趙新勝克力木阿不都熱依木
    中華胃食管反流病電子雜志 2018年1期
    關(guān)鍵詞:反流食管小鼠

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    隨著人類(lèi)飲食結(jié)構(gòu)的變化,高能量值食物的攝取量不斷提高,由飲食結(jié)構(gòu)不合理引起的肥胖癥逐漸引起了人們的關(guān)注。在消化系統(tǒng)良性疾病中,很多疾病的發(fā)生與肥胖有關(guān),其中常見(jiàn)的包括胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)、非酒精性脂肪肝、膽囊結(jié)石及胰腺炎等[1]。同時(shí)肥胖癥的患病率在全球范圍內(nèi)不斷增長(zhǎng),已成為了一項(xiàng)世界公共健康問(wèn)題。GERD同樣作為常見(jiàn)的消化道良性疾病,其與飲食習(xí)慣間的相關(guān)性不可忽視。近年國(guó)內(nèi)外許多研究者通過(guò)飲食誘導(dǎo)肥胖(diet-induced obesity,DIO)動(dòng)物模型來(lái)探討肥胖和相關(guān)代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制[2-3]。然而該模型在上述領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用,使得模型的成功建立已基本成熟,但其在GERD研究中的應(yīng)用很少見(jiàn)。因此本研究旨在探討肥胖與GERD的相關(guān)性及DIO動(dòng)物模型在該研究中的價(jià)值,以為今后肥胖與GERD相關(guān)性研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    資料與方法

    一、一般資料

    1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:SPF級(jí)雄昆明小鼠20只,8周齡,購(gòu)于新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,許可證號(hào):SCXK(新)2011-0001;飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所IVC系統(tǒng)動(dòng)物中心。研究員對(duì)20只小鼠進(jìn)行編號(hào)及體質(zhì)量測(cè)量,并排除體重變異較大的4只。采用Microsoft Office Excel軟件隨機(jī)分2組(各8只),即飲食誘導(dǎo)肥胖組(diet-induced obesity,DIO)組和正常對(duì)照(normal control,NC)組。小鼠以4只/籠飼養(yǎng)在自由進(jìn)食水的鼠籠內(nèi),每日給予12 h晝夜循環(huán),光照均始于北京時(shí)間8∶30分,止于20∶30分。

    2. 實(shí)驗(yàn)器材:電子天平(EL-5.2K),常州市天之平儀器設(shè)備有限公司;低溫高速離心機(jī)(1-14K),德國(guó)Sigma公司;抗凝采血管,美國(guó)BD公司;光學(xué)顯微鏡(Eclipse E200),日本尼康公司;三諾安穩(wěn)血糖儀及血糖試條,三諾生物傳感股份有限公司;D-葡萄糖,德國(guó)Sigma公司;HE染色相關(guān)試劑,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    二、方法

    1. DIO模型的建立:正式實(shí)驗(yàn)前,將所有小鼠在相同環(huán)境中標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。9周齡時(shí)開(kāi)始建立模型,DIO組小鼠給予高脂飼料(HFD,Lot:11111401,60%KJ%fat,D12492,Research Diets Inc.21.92 KJ/g),NC組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料(STD,Lot:08101506,10%KJ%fat,D12450B,Research Diets Inc.16.11 KJ/g),飼料成分見(jiàn)表1,其余處理均相同。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠自由飲水?dāng)z食,持續(xù)8周。每周3上午10∶00(北京時(shí)間)測(cè)量體質(zhì)量與飲食量。8周的飼養(yǎng)結(jié)束后,DIO組小鼠中體質(zhì)量超過(guò)NC組最高體質(zhì)量者可被視為肥胖小鼠。

    表1 HFD與STD成份及能量值(%)

    注:STD為標(biāo)準(zhǔn)飼料;HFD為高脂飼料

    2. 取材與標(biāo)本處理:實(shí)驗(yàn)第8周最后1天下午17∶00(北京時(shí)間)開(kāi)始對(duì)所有小鼠禁食,于次日11∶00(北京時(shí)間)進(jìn)行取材。將麻醉的動(dòng)物以平臥位固定,從腹部正中至劍突取3 cm切口,下腔靜脈取血注入于肝素抗凝采血管中。肉眼觀察皮下、腹股溝、腸系膜及各臟器周?chē)?,完整游離取材并稱(chēng)重;此外在距離胃食管交界處0.3和1.5 cm處剪斷取下胃食管組織,置于4%中性甲醛固定。

    3. 血生化指標(biāo)的測(cè)定:裝入采血管的血樣品以3 500 rpm/min的速度低溫離心5 min,取上層血清,-80 ℃保存,用于后續(xù)生化指標(biāo)測(cè)定。采用ELISA法檢測(cè)甘油三酯,總膽固醇,低密度脂蛋白含量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程及測(cè)量指標(biāo)濃度的計(jì)算嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    4. 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)與胰島素耐受試驗(yàn)(ITT):參照Uchida[4]和Yisireyili等[5]研究者的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),步驟如下:實(shí)驗(yàn)第8周最后1 d下午17∶00(北京時(shí)間)開(kāi)始對(duì)所有小鼠禁食,于次日11∶00(北京時(shí)間取材前進(jìn)行試驗(yàn)。GTT:試驗(yàn)開(kāi)始前測(cè)血糖濃度,然后腹腔內(nèi)以2 g/kg的量注射D-葡萄糖,并在注射后30、60、90、120 min分別監(jiān)測(cè)血糖;ITT實(shí)驗(yàn):GTT試驗(yàn)結(jié)束后向小鼠腹腔內(nèi)注射胰島素0.75 U/kg,其后分別在15、30、45、60 min分別檢測(cè)血糖并記錄。參照王科等[6]的實(shí)驗(yàn)方法計(jì)算GTT、ITT曲線(xiàn)下面積(area under curve,AUC)。

    5. 小鼠組織病理學(xué)檢查:4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋,制成5 μm厚切片行HE染色。切片質(zhì)量及各組織形態(tài)學(xué)改變均由富有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師診斷。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    結(jié) 果

    一、NC組與DIO組小鼠體型、腹腔內(nèi)脂肪分布、體重、進(jìn)食量及血糖的比較

    DIO組小鼠在體型上明顯比NC組小鼠體型大,并且NC組小鼠被毛順滑,而DIO組小鼠的被毛普遍有出油的現(xiàn)象(見(jiàn)圖1A);經(jīng)解剖腹腔2組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),DIO組小鼠腸系膜、腹股溝及腹膜后等部位出現(xiàn)明顯的脂肪堆積(見(jiàn)圖1B,C,D)。體重為反應(yīng)小鼠機(jī)體整體狀況的基本指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前DIO組小鼠體質(zhì)量為(22.31±0.52)g,NC組小鼠體質(zhì)量為(22.60±0.31)g,2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);8周的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,DIO組小鼠平均每日進(jìn)食量為(2.92±0.41)g,NC組為(2.68±0.30)g,2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)結(jié)束后DIO組小鼠體質(zhì)量增加量為(23.16±2.82)g,NC組小鼠體質(zhì)量增加量為(13.40±1.31)g,2組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

    二、NC組與DIO組小鼠血生化指標(biāo)的比較

    DIO組小鼠血漿總膽固醇,低密度脂蛋白水平明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),甘油三酯水平略高于對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。

    組別例數(shù)平均每日進(jìn)食量(g)體重增加量(g)NC組82.68±0.3013.40±1.31DIO組82.92±0.4123.16±2.82t值-1.30-8.86P值0.210.000

    表3 血生化指標(biāo)比較

    三、NC組與DIO組小鼠糖耐量和胰島素耐受的變化

    GTT結(jié)果顯示,試驗(yàn)開(kāi)始之初NC組和DIO組小鼠血糖上升明顯,DIO組小鼠血糖2 h內(nèi)不能恢復(fù)之前濃度且維持在一個(gè)比較高的水平,而NC組2 h內(nèi)能恢復(fù)到正常范圍內(nèi)的濃度,經(jīng)過(guò)計(jì)算AUC得知,DIO組小鼠與NC組小鼠在整體水平上有差異(P<0.05),由此可見(jiàn),DIO組小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了糖耐量異常的現(xiàn)象。ITT結(jié)果顯示,NC組小鼠血糖濃度有一次較大幅度的下降,2 h內(nèi)能夠恢復(fù)之前的濃度;而CRS組小鼠的血糖只是略有下降,2 h不能恢復(fù)到原來(lái)的濃度。同樣經(jīng)過(guò)計(jì)算曲線(xiàn)下面積得知,DIO組小鼠與NC組小鼠在整體水平上有差異(P<0.05);說(shuō)明胰島素已經(jīng)不能充分發(fā)揮其正常的生理功能,可以初步估計(jì)機(jī)體已經(jīng)出現(xiàn)了胰島素抵抗的現(xiàn)象,見(jiàn)圖2。

    四、NC組與DIO組小鼠胃、食管組織學(xué)及其周?chē)镜淖兓?/h3>

    經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)DIO組小鼠除了腹腔內(nèi)各部位脂肪嚴(yán)重堆積,在胃食管交界處周?chē)瑯映霈F(xiàn)了明顯的脂肪堆積;HE染色及鏡下觀察顯示,在DIO組小鼠食管胃組織可見(jiàn)充血,炎癥細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)浸潤(rùn),但NC組未見(jiàn)明顯異常,見(jiàn)圖3。

    圖3 2組小鼠胃食管外觀及組織病理學(xué)變化

    討 論

    隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們生活水平的提高,肥胖及相關(guān)消化道疾病人群的數(shù)量近年來(lái)呈現(xiàn)一個(gè)迅速上升的趨勢(shì),對(duì)人類(lèi)健康帶來(lái)了不同程度的危害。其中肥胖與GERD的相關(guān)性研究引起了越來(lái)越多的研究者的注意。GERD作為影響人類(lèi)健康的消化道良性疾病之一,認(rèn)為肥胖是其發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]。全世界約10%~40%的成年人飽受著胃食管反流之痛[7],同樣約有30%的人處于超重或肥胖狀態(tài)并呈逐年上升趨勢(shì)[8]。多項(xiàng)橫斷面流行病學(xué)研究報(bào)道稱(chēng),肥胖人群中GERD的發(fā)病率高于非肥胖人群[9-10]。El-Serag等[11]對(duì)453名醫(yī)院職工進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn),26%的人每周都會(huì)出現(xiàn)燒心或反流癥狀;其中196名職工愿意接受進(jìn)一步調(diào)查并進(jìn)行了胃鏡檢查,結(jié)果顯示,不同BMI組,即BMI<25、25~30和>30 kg/cm2,存在GERD癥狀者所占的比例分別是23.3%、26.7%、50%,而糜爛性食管炎者所占的比例分別為12.5%、29.8%、26.9%。此外在其他研究中發(fā)現(xiàn),增重>5 kg的人出現(xiàn)GERD癥狀的危險(xiǎn)性為正常人的2.7倍[12]。故,在上述研究的基礎(chǔ)上,本課題組通過(guò)建立DIO動(dòng)物模型,觀察肥胖所引起食管、胃的變化。

    建模過(guò)程中,長(zhǎng)期進(jìn)食高脂飼料的模型組小鼠,體質(zhì)量明顯高于標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)組,其中75%的小鼠發(fā)育為DIO。整個(gè)造模期間,模型組小鼠體質(zhì)量呈緩慢增長(zhǎng),雖然飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠動(dòng)物模型的建立耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月,但此模型較為真實(shí)地模擬了人類(lèi)肥胖癥患者的病因和體重增長(zhǎng)過(guò)程,即由長(zhǎng)期高熱量飲食和缺乏運(yùn)動(dòng)的生活狀態(tài)所致。此肥胖模型動(dòng)物伴有糖耐量異常、胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝紊亂,符合人類(lèi)肥胖癥患者所具有的血液生化指標(biāo)的變化,所以此模型可用于評(píng)價(jià)肥胖所誘導(dǎo)胃食管反流所引起的病理變化。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)中肥胖引起的胃食管的變化,我們發(fā)現(xiàn)DIO組小鼠腹腔內(nèi)各部位脂肪堆積嚴(yán)重,更重要的是在胃食管交界處周?chē)瑯映霈F(xiàn)了明顯的脂肪堆積,這一變化初步驗(yàn)證了“肥胖是引起胃食管反流的病理基礎(chǔ)”之一。進(jìn)一步通過(guò)HE染色觀察2組小鼠食管、胃組織形態(tài)學(xué)變化時(shí)發(fā)現(xiàn),食管及胃組織上皮細(xì)胞增厚、黏膜層各類(lèi)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)等變化。因?yàn)椋谖甘彻苎装Y進(jìn)展和糜爛形成時(shí),通常在鏡下可見(jiàn)沿食管長(zhǎng)軸有條狀糜爛病變,也可見(jiàn)病變區(qū)域上皮壞死脫落,形成淺表性上皮缺損,其上由炎性纖維素膜覆蓋,其下可見(jiàn)中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞,漿細(xì)胞浸潤(rùn),炎癥改變。因此,DIO小鼠胃食管組織出現(xiàn)的組織學(xué)變化,相對(duì)接近肥胖導(dǎo)致胃食管反流的一個(gè)重要的病理變化。

    綜上所述,目前關(guān)于肥胖所引起的GERD發(fā)病原因和機(jī)制尚不清楚。臨床研究往往因不易獲取倫理批準(zhǔn)或患者知情同意、無(wú)法及時(shí)全面觀察機(jī)體病理生理變化及各層組織形態(tài)學(xué)變化等因素而受到限制,而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)P偷慕⒔鉀Q了上述問(wèn)題。然而DIO小鼠模型具有穩(wěn)定性及重復(fù)性較好,操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等優(yōu)勢(shì),并且整個(gè)造模期間,沒(méi)有動(dòng)物死亡。因此,本實(shí)驗(yàn)可以為后期進(jìn)一步研究肥胖所引起GERD的機(jī)制提供較好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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