花椒麻味物質(zhì)替代模板分子印跡聚合物的制備

李 耀，何葉子，陳光靜,2,3，闞建全,2,3,*

花椒（Zanthoxylum bungeanum）含有多種生理活性成分，如揮發(fā)油類(lèi)、生物堿類(lèi)和酰胺類(lèi)物質(zhì)，目前從花椒中分離純化得到的酰胺類(lèi)物質(zhì)主要是α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素及其羥基山椒素（圖1），這類(lèi)酰胺物質(zhì)被稱(chēng)為花椒麻味物質(zhì)（numb-taste components of Z. bungeanum，NTCZB），山椒素是最能代表花椒引起麻刺感的成分。NTCZB具有麻醉、抑菌、祛風(fēng)除濕、殺蟲(chóng)和抗氧化等功效，具有很好的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。但NTCZB在空氣中不穩(wěn)定，目前還沒(méi)有市售的標(biāo)準(zhǔn)品，傳統(tǒng)分離純化方法存在繁瑣、成本高等缺點(diǎn)，而NTCZB的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、含量等方面還有待深入研究，因此迫切需要研究出NTCZB更加高效的分離純化方法[3-4]。分子印跡技術(shù)為NTCZB的分離純化提供了新的思路。在分子印跡技術(shù)中，采用與印跡分子結(jié)構(gòu)相似的化合物作為替代模板分子，可以解決一些印跡分子難獲得、溶解性差等問(wèn)題[5-6]。用替代模板分子制備的分子印跡聚合物（molecular imprinting polymers，MIPs）對(duì)目標(biāo)印跡分子仍具有較好的印跡效果[7-8]。近些年替代模板分子印跡技術(shù)快速發(fā)展，但目前鮮見(jiàn)有關(guān)采用替代模板分子制備N(xiāo)TCZB的MIPs相關(guān)報(bào)道。

NTCZB標(biāo)準(zhǔn)品制備過(guò)程繁雜、成本高，其分子鏈上的多個(gè)不飽和碳碳雙鍵容易發(fā)生共價(jià)鍵化學(xué)反應(yīng)，使NTCZB不易洗脫[9]。為解決上述問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)采用山椒素的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物（molecular structural analogs of alkyl amides，LM，見(jiàn)圖1d）為NTCZB分子印跡的替代模板分子（理論相對(duì)分子質(zhì)量為271），采用本體聚合的方法制備多種NTCZB的MIPs，從中選出對(duì)NTCZB的印跡效果最優(yōu)的MIPs，并用其吸附花椒萃取液中的NTCZB，為高純度NTCZB的分離純化奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)特點(diǎn)物質(zhì)的分子印跡技術(shù)提供方法借鑒。

圖1 NTCZB主要成分及LM的分子結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Molecular structures of numb-taste components of Z. bungeanum and structural analogs of alkyl amides

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NTCZB標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%），由實(shí)驗(yàn)室按照逆流干柱層析法、制備型高效液相色譜法等工序制備[10]；LM（純度＞95%）由實(shí)驗(yàn)室按照Menozzismarrito等[11]提供的方法制備；鮮花椒 重慶凱揚(yáng)農(nóng)業(yè)有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EDMA）、2-乙烯基吡啶（2-vinylpyridine，2-Vpy）、甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）、丙烯酰胺（acrylamide，AM）（均為分析純） 阿拉丁公司；偶氮二異丁腈（2,2-azobisisobutyronitrile，AIBN）、氯仿、甲醇、冰乙酸、乙腈（均為分析純） 成都科隆試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

DSHZ-300型水浴振蕩儀 蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5810型離心機(jī) 德國(guó)艾本德公司；超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；CP214型電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司；UV-260型紫外光譜儀 日本島津公司；Equinox55傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司；S-3400N I型掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；R215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士Büchi公司。

1.3 方法

1.3.1 LM與功能單體混合溶液的紫外吸收光譜測(cè)定[12-13]

分別吸取LM-乙腈溶液100 μL、功能單體（2-Vpy、AM、MAA）的乙腈溶液200 μL及LM與功能單體混合物（物質(zhì)的量比為1∶2）于10 mL比色管中，乙腈定容，超聲10 min后，于4 ℃避光靜置12 h，以乙腈作為參比溶液，在波長(zhǎng)190～400 nm進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.2 不同物質(zhì)的量比的功能單體與LM的紫外光譜掃描

固定LM-乙腈溶液1 mL于10 mL比色管中，分別加入功能單體（2-Vpy、AM、MAA）的乙腈溶液，使LM與功能單體物質(zhì)的量比分別為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，乙腈定容，超聲10 min后在4 ℃環(huán)境下避光保存12 h，以相同濃度功能單體為參比溶液，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.3 NTCZB的MIPs制備

MIPs的不同聚合條件見(jiàn)表1。以實(shí)驗(yàn)組編號(hào)1為例，聚合物的制備過(guò)程具體如下[14]：稱(chēng)取67.75 mg（0.25 mmol）LM于50 mL圓底燒瓶中，加入12 mL乙腈溶解，然后加1 mmol功能單體MAA，超聲30 min，使其充分溶解，5 ℃避光放置過(guò)夜，使LM和功能單體充分作用；加入4 mmol交聯(lián)劑EDMA和10 mg引發(fā)劑AIBN，充分溶解后，向混合液中通氮?dú)?0 min，使瓶?jī)?nèi)保持惰性氛圍，并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用封口膜密封燒瓶；于50 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)熱引發(fā)聚合4 h后，再于60 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)熱引發(fā)聚合20 h，得乳白色塊狀聚合物，將聚合物反復(fù)研磨，過(guò)200 目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩；用丙酮自然沉降3 次，棄去上層濁液，以除去聚合物中過(guò)細(xì)小的粒子；將沉淀物真空干燥后，以甲醇-乙酸（9∶1，V/V）為洗脫液進(jìn)行索氏提取，直至索氏提取器內(nèi)溶液不含LM為止；再用甲醇反復(fù)洗滌聚合物以去除乙酸，將處理好的MIPs放置于真空干燥箱內(nèi)，40 ℃干燥至恒質(zhì)量，待用。各條件下制備N(xiāo)TCZB的MIPs記為MIPs l～MIPs 16（表1）。作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)制備了空白印跡聚合物（non-imprinting polymers，NIPs），其制備方法與MIPs的步驟相同，只是在聚合過(guò)程中不加入LM[15]，對(duì)應(yīng)樣品記為NIPs l～NIPs 16。

表1 聚合物的制備條件Table 1 Conditions for preparation of polymers

1.3.4 NTCZB高效液相色譜檢測(cè)條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[16]的繪制

高效液相色譜檢測(cè)條件：色譜柱-Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-水（60∶40，V/V），流速1 mL/min，保留時(shí)間15 min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫40 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。配制0.01～0.4 mg/mL的NTCZB標(biāo)準(zhǔn)溶液，高效液相色譜檢測(cè)該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3 次檢測(cè)結(jié)果中目標(biāo)峰的平均峰面積（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，NTCZB標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程：y=17 765x＋125（R2=0.999）。

1.3.5 MIPs的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取50 mg MIPs，置于20 mL具塞錐形瓶中，加入8 mL的一定質(zhì)量濃度的NTCZB-氯仿溶液，于振蕩器上25 ℃、150 r/min振蕩12 h后，倒入10 mL離心管中6 000 r/min離心5 min，移取適量上層清液，微孔濾膜過(guò)濾后，高效液相色譜檢測(cè)NTCZB濃度，差減法計(jì)算該聚合物對(duì)NTCZB的吸附量[17]，計(jì)算見(jiàn)式（1）：

式中：Q為MIPs的吸附量/（mg/g）；C1為氯仿溶液中NTCZB的原始質(zhì)量濃度/（μg/mL），C0為吸附后上層清液中NTCZB的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為所用氯仿溶液的體積/mL；m為印跡聚合物的質(zhì)量/g。

分子印跡研究中通常用特異因子α表示印跡效果。特異結(jié)合量和特異因子分別定義為式（2）、（3）：

式中：ΔQ為特異結(jié)合量/（mg/g）；QMIPs為MIPs的吸附量/（mg/g）；QNIPs為NIPs的吸附量/（mg/g）；α為特異因子。

1.3.6 MIPs的紅外表征[18]

稱(chēng)取MIPs和NIPs各10 mg，1 000 mg溴化鉀，研磨充分后于100 ℃烘干至恒質(zhì)量，經(jīng)壓片后，在傅里葉變換紅外光譜儀上進(jìn)行測(cè)定（掃描范圍400～4 000 cm-1）。

1.3.7 MIPs對(duì)花椒中NTCZB的分子印跡驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取1.0 g粉碎后的花椒粉末置于75 mL氯仿中，于35 ℃、150 r/min振蕩提取12 h，再將其轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，振搖2 min，靜置分層后，收集氯仿萃取液，定容于100 mL容量瓶中。稱(chēng)取250 mg MIPs，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL的上述萃取液，于振蕩器上25 ℃、150 r/min振蕩5 h后，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中6 000 r/min離心5 min，收集固體沉淀物，以甲醇為洗脫液對(duì)固體沉淀物索氏抽提24 h，將洗脫液濃縮至100 mL，高效液相色譜檢測(cè)洗脫液中NTCZB的含量[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用Origin 8.0和Excel 2003處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖，結(jié)果以 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單體與LM的紫外光譜分析

根據(jù)吸光度加和性，若溶液中各個(gè)組分彼此間不發(fā)生作用，則吸光度就等于該溶液中各個(gè)組分的吸光度之和，即混合物的理論吸光度，而該混合物的實(shí)際吸光度為該混合物溶液在該波長(zhǎng)下實(shí)測(cè)的紫外吸光度，理論吸光度與實(shí)際測(cè)量值差值越大，表明二者相互作用也越大。

圖2 LM、功能單體及其混合物的紫外吸收光譜Fig. 2 Ultraviolet absorption spectra of LM, functional monomer and their mixture

從圖2可以看出，所有樣品的理論吸光度（E1）均大于實(shí)際測(cè)量值（E2），說(shuō)明LM與功能單體間發(fā)生了相互作用，原因是LM上存在?；土u基，與功能單體形成氫鍵[20]。LM-MAA在波長(zhǎng)200 nm處的實(shí)測(cè)值與理論值差值為0.937±0.095，LM-AM波長(zhǎng)200 nm處的實(shí)測(cè)值與理論值差值為0.977±0.101，LM-2-Vpy波長(zhǎng)200 nm處的實(shí)測(cè)值與理論值差值為1.248±0.138，從差值上可以看出LM與2-Vpy相互作用最大，理論上說(shuō)，用2-Vpy為功能單體合成的MIPs具有更好的穩(wěn)定性和特異性識(shí)別能力[21]。

由圖3A、B、C可知，隨著加入功能單體量的增加，LM和功能單體混合體系的最大吸收峰的吸光度呈上升趨勢(shì)，這是因?yàn)長(zhǎng)M上的—NH—、C=O和—OH基團(tuán)與3 種功能單體上含有的助色團(tuán)和生色團(tuán)相連，產(chǎn)生電子躍遷，使混合體系的最大吸收峰的吸光度增加，同時(shí)使最大吸收峰向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)，這說(shuō)明隨著功能單體的加入，LM與相應(yīng)的功能單體通過(guò)氫鍵生成了新的復(fù)合物，而該復(fù)合物的穩(wěn)定性直接影響MIPs的吸附效果[22]。吸光度變化趨于平緩時(shí)，說(shuō)明混合物體系趨于穩(wěn)定，此時(shí)進(jìn)入平緩區(qū)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的混合物比例是最佳的配比[23]，從圖3D可看出，LM與MAA、AM、2-Vpy在對(duì)應(yīng)物質(zhì)的量比在1∶4之后吸光度變化均較之前更加平緩，可推斷LM與功能單體物質(zhì)的量比為1∶4可能是聚合的較佳比例。

圖3 不同比例功能單體對(duì)預(yù)組裝體系紫外光譜的影響Fig. 3 Effect of different ratios between functional monomers on UV spectrum of preassembled system

差示紫外光譜掃描與不同物質(zhì)的量比的功能單體加入量的紫外光譜掃描實(shí)驗(yàn)方法類(lèi)似，僅將參比溶液換成相同濃度的LM溶液。LM與2-Vpy相互作用最大，故選擇LM-2-Vpy組裝體系進(jìn)行差示紫外光譜分析，由于功能單體2-Vpy與LM以及其主客體復(fù)合物最大吸收波長(zhǎng)在206 nm波長(zhǎng)處，參照文獻(xiàn)[24]，LM與功能單體反應(yīng)公式可以推導(dǎo)整理為式（4）：

式中：n為L(zhǎng)M和功能單體2-Vpy的結(jié)合比例（n=1，2，3，…）；b0為2-Vpy的濃度；a0為L(zhǎng)M的濃度；ΔA為L(zhǎng)M與LM-2-Vpy混合物的紫外吸光度差值；K為反應(yīng)平衡常數(shù)。Δε為復(fù)合物與功能單體的摩爾吸光系數(shù)差值；Ι為比色皿厚度。

以ΔA/bn0對(duì)ΔA作圖，可以推導(dǎo)出n值，從而得知在乙腈溶液中LM與功能單體的作用模式，進(jìn)而揭示分子印跡作用機(jī)理。以ΔA/bn0對(duì)ΔA作圖發(fā)現(xiàn)，物質(zhì)的量比為1∶1、1∶2時(shí)并沒(méi)有出現(xiàn)很好的線(xiàn)性關(guān)系，這是由于推導(dǎo)反應(yīng)公式的假設(shè)條件為b0遠(yuǎn)大于a0，即功能單體加入量遠(yuǎn)大于LM，這2 種濃度并不滿(mǎn)足上述假設(shè)條件。因此作線(xiàn)性關(guān)系圖時(shí)舍棄這2 種比例。

從圖4可以看出，當(dāng)n為3時(shí)，ΔA/bn0對(duì)ΔA作圖可以擬合成一條直線(xiàn)（R2=0.963）；當(dāng)n為4時(shí)，ΔA/bn0對(duì)ΔA作圖也可以擬合成一條直線(xiàn)（R2=0.974），這說(shuō)明在研究的濃度范圍內(nèi)主客體主要存在形式為1 個(gè)LM與3 個(gè)或者4 個(gè)2-Vpy分子發(fā)生作用，即1 個(gè)LM周?chē)辽傩枰? 個(gè)2-Vpy功能單體才能形成穩(wěn)定的復(fù)合物[25]。

圖4 206 nm波長(zhǎng)處ΔA/bn0對(duì)ΔA的關(guān)系圖Fig. 4 Plots of ΔA/bn0 versus ΔA at 206 nm

2.2 不同制備條件對(duì)MIPs的分子印跡效果的影響

由表2可知，MIPs 1、MIPs 2、MIPs 3對(duì)NTCZB的吸附量的大小關(guān)系為MIPs 3＞MIPs 2＞MIPs l，其特異性吸附效果也呈此趨勢(shì)，即α3＞α2＞α1。說(shuō)明以2-Vpy為功能單體時(shí)，MIPs 3對(duì)NTCZB的印跡效果最好，這與功能單體和LM的紫外光譜分析的結(jié)果吻合。

MIPs 3～MIPs 7對(duì)NTCZB的吸附量的大小為MIPs 7＞MIPs 6＞MIPs 3＞MIPs 5＞MIPs 4，其特異性吸附效果為α3＞α5＞α6＞α4＞α7，說(shuō)明替代模板與2-Vpy物質(zhì)的量比為1∶4時(shí)MIPs的印跡效果最好，這與紫外光譜分析研究LM和功能單體相互作用的結(jié)果吻合。

MIPs 8～MIPs 11和MIPs 3對(duì)NTCZB的吸附量的大小關(guān)系為MIPs 9＞MIPs 3＞MIPs 10＞MIPs 11＞MIPs 8，其特異性吸附效果為α9＞α3＞α8＞α10＞α11，隨著交聯(lián)劑用量增大，吸附量先增大而后減少，非特異性吸附一直增大，這是因?yàn)榻宦?lián)劑過(guò)量時(shí)，易發(fā)生自聚，使所得聚合物內(nèi)的非特異性吸附位點(diǎn)增多，從而造成非特異性吸附量增大[26]，因此實(shí)驗(yàn)選擇功能單體和交聯(lián)劑物質(zhì)的量比為2-Vpy與EDMA 4∶20。

MIPs 9、MIPs 12和MIPs 13的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MIPs 9對(duì)NTCZB的吸附量和特異性吸附效果最好，這是由于溶劑用量較小時(shí)，溶液中各組分濃度較大，這會(huì)使功能單體復(fù)合物被網(wǎng)絡(luò)包裹的程度過(guò)于致密，致孔劑不能充分進(jìn)入聚合物網(wǎng)絡(luò)形成大孔結(jié)構(gòu)；溶劑的用量較大時(shí)，反應(yīng)溶液濃度較低，自由基引發(fā)聚合反應(yīng)速度減慢，延長(zhǎng)了聚合反應(yīng)的時(shí)間[17]。MIPs 9、MIPs 14和MIPs 15的結(jié)果表明，其他條件相同時(shí)，溫度A條件下制備的MIPs 9對(duì)NTCZB的印跡效果最好。

MIPs 9、MIPs 16對(duì)NTCZB的吸附量的大小關(guān)系為MIPs 9＞MIPs 16，其特異因子α也呈此趨勢(shì)，即MIPs 9的印跡效果優(yōu)于MIPs 16，這是因?yàn)榫酆戏磻?yīng)制備MIPs的過(guò)程中，NTCZB上的碳碳雙鍵容易與交聯(lián)劑發(fā)生共價(jià)鍵化學(xué)反應(yīng)而形成大分子結(jié)構(gòu)，使NTCZB沒(méi)有被洗脫完全，從而造成NTCZB的再吸附時(shí)印跡孔穴的浪費(fèi)和印跡位點(diǎn)利用率不高[9]。

綜上所述，MIPs 9樣品的分子印跡效果最好，在上述條件下對(duì)制備MIPs 9進(jìn)行紅外表征和吸附性能實(shí)驗(yàn)研究。

表2 不同制備條件的MIPs的分子印跡效果Table 2 Imprinting effect of MIPs prepared under different conditions

2.3 MIPs 9對(duì)NTCZB印跡前后的紅外光譜分析

由圖5可知，3 條曲線(xiàn)的出峰位置很相近，但仍存在很多差異，洗脫前MIPs 9、洗脫后MIPs 9、NIPs 9在2 965 cm-1附近的雙峰是功能單體2-Vpy中吡啶環(huán)上的C—H伸縮振動(dòng)峰，洗脫前MIPs 9在此處的峰形明顯區(qū)別于洗脫后MIPs 9和NIPs 9，這是因?yàn)長(zhǎng)M上的酰基與2-Vpy發(fā)生相互作用，形成氫鍵而締合于MIPs上，洗脫前MIPs 9在1 540 cm-1處和1 635 cm-1處比洗脫后MIPs 9和NIPs 9的強(qiáng)度弱，這主要是LM上的仲酰胺N—H和C=O反式存在的吸收峰產(chǎn)生[27]，洗脫前MIPs 9在2 853 cm-1處的峰是LM上的飽和C—H伸縮振動(dòng)，洗脫前MIPs 9與洗脫后MIPs 9、NIPs 9的這些差異說(shuō)明LM已經(jīng)通過(guò)氫鍵結(jié)合在了MIPs上[28]；洗脫后MIPs 9和NIPs 9幾乎沒(méi)有差別，這說(shuō)明LM已經(jīng)完全被洗脫下來(lái)[29-30]。

圖5 MIPs 9和NIPs 9的紅外光譜圖Fig. 5 IR spectra of non-imprinted polymers and molecularly imprinted polymers

2.4 MIPs 9對(duì)花椒中NTCZB的分子印跡驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 花椒萃取液、甲醇洗脫液及NTCZB標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig. 6 HPLC profiles of the extract of prickly ash, the methanol eluate and NTCZB standard

由圖6可知，甲醇洗脫液與NTCZB標(biāo)準(zhǔn)品的峰形及出峰時(shí)間一致，可確證分離純化出的物質(zhì)主要成分是NTCZB；花椒萃取液中NTCZB的峰面積占總峰面積的（72.65±1.27）%，MIPs 9的甲醇洗脫液中NTCZB占總峰面積的（94.60±1.52）%，NTCZB占總峰面積的比例提高了約21.95%；同時(shí)，高效液相色譜檢測(cè)到濃縮的甲醇洗脫液中NTCZB質(zhì)量濃度為（34.2±3.1）μg/mL，經(jīng)計(jì)算MIPs 9對(duì)花椒的氯仿萃取液中NTCZB的吸附量為（14.64±0.80）mg/g。結(jié)果表明，MIPs 9對(duì)花椒萃取液中的NTCZB有較強(qiáng)的特異性吸附能力[31]。

3 結(jié) 論

取LM 0.25 mmol，以2-Vpy為功能單體，LM、功能單體、交聯(lián)劑物質(zhì)的量比為1∶4∶20，乙腈12 mL，AIBN 10 mg，在50 ℃恒溫水浴聚合4 h后再在60 ℃恒溫水浴聚合20 h，該條件下合成的MIPs對(duì)NTCZB具有較好的特異性吸附效果；在該條件下制備的MIPs可以吸附花椒萃取液中的NTCZB，吸附量達(dá)到（14.64±0.80）mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：分子印跡技術(shù)可以應(yīng)用于NTCZB標(biāo)準(zhǔn)品的分離純化。采用LM能夠制備出對(duì)NTCZB具有較強(qiáng)印跡效果的MIPs。本研究為具有該分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)物質(zhì)的MIPs的制備提供了方法借鑒，同時(shí)也對(duì)NTCZB的研究和應(yīng)用具有借鑒價(jià)值。