非小細(xì)胞肺癌患者癌組織表皮生長因子受體基因18～21號外顯子的堿基序列突變情況觀察

周建平,徐德 ,王代文,程君

(1攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院,四川攀枝花617000 ； 2攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院；3攀枝花市中心醫(yī)院)

肺癌是當(dāng)今世界發(fā)病率和病死率增長最快，對人類生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的85%。NSCLC對化療相對不敏感。表皮生長因子受體(EGFR)基因的酪氨酸激酶(TK)結(jié)構(gòu)域中的突變與這些癌癥對抑制EGFR激酶活性藥物的敏感性增加有關(guān)。晚期NSCLC患者EGFR突變狀態(tài)對靶向藥物的療效有預(yù)測作用[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，10%～35%的NSCLC患者會出現(xiàn)EGFR藥物致敏突變。約10%的高加索NSCLC患者癌組織中存在EGFR藥物致敏突變，但東亞人群這一突變比例超過50%[4]。EGFR突變可導(dǎo)致EGFR信號通路被過度活化，最終誘發(fā)惡性腫瘤。 因此，對NSCLC患者進(jìn)行EGFR基因突變檢測是開展EGFR靶向治療的重要前提，快速并準(zhǔn)確地檢測患者的EGFR突變狀態(tài)及類型對臨床用藥至關(guān)重要。 攀枝花-西昌地區(qū)(攀西地區(qū))位于四川省西南部攀西大裂谷的安寧河平原，是中國西南地區(qū)大型鋼鐵、釩鈦冶煉基地，有全國最大的彝族聚居區(qū)，具有典型南亞熱帶河谷氣候特征。獨特的氣候特點、彝漢等多民族雜居、經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)、對外交通相對不便等現(xiàn)狀，使得攀西地區(qū)NSCLC患者的EGFR基因突變狀況可能具有一定的獨特性。目前，尚無攀西地區(qū)肺癌EGFR基因突變情況的相關(guān)報道。2015年1月～2017年5月，我們觀察了攀西地區(qū)72例NSCLC患者癌組織EGFR基因18～21號外顯子的堿基序列突變情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取攀枝花市中心醫(yī)院、攀鋼總醫(yī)院及攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院2015年1月～2017年5月間收治的NSCLC患者72例，其中男47例、女25例，年齡38～80歲，其中>61歲者35例、≤61歲者37例，腺癌45例、非腺癌27例，漢族39例、彝族33例。72例患者均行腫瘤切除術(shù)，術(shù)中保留癌組織，常規(guī)中性甲醛液固定、石蠟包埋、切片及HE染色后備用。另選擇本院病理科保存的20例非肺癌患者手術(shù)切取的正常肺組織標(biāo)本作為對照。

1.2 癌組織、正常肺組織EGFR基因18～21號外顯子堿基序列分析方法

1.2.1 EGFR基因DNA提取 取癌組織、肺組織，5 μm厚切片5～8張，提取基因組DNA。微量紫外分光光度計測量樣品DNA的濃度及純度，合格樣品的OD260/OD280值應(yīng)介于1.7～2.0之間，樣品不純或濃度不足者應(yīng)重新抽提。所提取DNA保存在-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 EGFR基因18～21號外顯子堿基序列特異性PCR及產(chǎn)物測序 針對EGFR基因18～21號外顯子設(shè)計并合成引物。反應(yīng)條件：95 ℃、2 min；94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。PCR擴(kuò)增采用的正反向引物序列見表1。

表1 EGFR基因18～21號外顯子引物序列

1.3 EGFR基因突變分析方法 EGFR基因外顯子標(biāo)準(zhǔn)序列從美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(NCBI， http://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲取，參考序列編號為NM_005228.4。采用DNAstar分子生物學(xué)基本序列分析軟件包的MegAlign程序?qū)Ρ菶GFR外顯子標(biāo)準(zhǔn)序列與所測患者樣本序列，分析樣本序列的堿基突變。所有堿基突變類型與NCBI的EGFR臨床基因突變數(shù)據(jù)庫(ClinVar)進(jìn)行比對，確定樣本突變類型是否為病理性突變，是否對應(yīng)特定的藥物反應(yīng)類型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用IBM SPSS Statistics 17統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理?；蛲蛔兦闆r與性別、年齡、組織學(xué)類型、有無吸煙等臨床病理特征的相關(guān)性分析用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

20例正常肺部組織中均未檢測到EGFR基因18～21號外顯子序列攜帶基因突變。NSCLC癌組織EGFR基因18～21號外顯子的堿基突變率58.3%(42/72)，二者比較，P<0.05。72例患者EGFR基因18～21外顯子序列中共發(fā)現(xiàn)60種堿基突變，總突變數(shù)144個。突變類型包括：點突變、缺失突變、插入突變和插入/缺失突變。外顯子18突變率8.3%(6/72)，其中點突變4例；外顯子19突變率29.2%(21/72)，其中點突變21例、插入/缺失突變13例、病理性突變4例；外顯子20突變率37.5%(27/72)，其中點突變9例、缺失突變2例、插入/缺失突變1例、病理性突變1例；外顯子21突變率4.2%(3/72)，其中點突變1例、插入突變1例、病理性突變1例。其中外顯子18突變4種，其中c.2127A>C 1例、c.2127A>G 3例、c.2127A>T 2例、c.2147A>G 1例；外顯子19突變40種，其中c.2189T>A 1 例、c.2198delC 1例、c.2200G>T 1例、c.2211delA 1例、c.2218delA 1例、c.2235G>A 1例、c.2236_2237delGAinsAC 1 例、c.2236G>A 1例、c.2237A>C 1例、c.2238delA 2例、c.2240_2243delTAAGinsCTCC 3例、c.2240T>C 2例、c.2241_2243delAAGinsTCC 1例、c.2242_2243delAGinsCC 3例、c.2243G>C 2例、c.2245G>A 8例、c.2250A>C 5例、c.2252_2259delCATCTCCGinsACAAGGAA 2例、c.2253A>C 1例、c.2257_2259delCCGinsGAA 2例、c.2258C>A 1例、c.2259G>A 2例、c.2261_2264delAGGCinsTACT 3例、c.2261A>T 1例、c.2262delA 1例、c.2263_2264delGCinsCT 1例、c.2263G>C 1例、c.2266A>G 2例、c.2268_2269delCAinsTG 5例、c.2269A>C 1例、c.2269A>G 2 例、c.2270_2274delAGGAAinsTCAGT 1例、c.2270A>T 6例、c.2272_2275delGAAAinsAGTT 2例、c.2272G>A 1例、c.2275A>G 1例、c.2275delA 1例、c.2278_2279delCTinsTG 7例、c.2281_2282delGAinsTT 5例、c.2281G>T 2例；外顯子20突變14種，分別為c.2292delC 1例、c.2326C>T 1例、c.2361G>A 23例、c.2374C>G 1例、c.2387G>T 1例、c.2427T>A 1例、c.2431_2432insA 1例、c.2432_2433delCCinsAT 1例、c.2438A>T 1例、c.2440C>A 1例、c.2452T>A 1例、c.2456_2457delTGinsCC 1例、c.2461delA 1例、c.2463C>G 1例；外顯子21突變2種，分別為c.2524_2525insC 1例、c.2573T>G 2例。

與ClinVar比對后發(fā)現(xiàn)6種癌癥病理相關(guān)的堿基突變。其中，良性變異1種(c.2361G>A)，突變率31.9%(23/72)；靶向藥物敏感型突變1種(c.2830T>G)，突變率2.8%(2/72)；其它致癌相關(guān)突變4種。癌癥病理相關(guān)突變的總體突變率為12.5%(9/72)，其中靶向藥物敏感型突變的總體突變率為2.8%(2/72)，其在EGFR突變樣本中的比例為4.8%(2/42)，其中外顯子21突變c.2573T>G 突變可導(dǎo)致EGFR蛋白Leu858Arg突變，是EGFR靶向治療敏感型突變，突變率2.8%(2/72)。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，除NSCLC患者年齡與EGFR基因突變率可能有一定相關(guān)性(P=0.05)外,性別、吸煙史、組織學(xué)類型、民族等因素與EGFR基因突變率均無關(guān)(P均>0.05)。

3 討論

EGFR突變主要發(fā)生在EGFR-TK，EGFR-TK的突變是NSCLC的重要癌癥驅(qū)動因子，抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，可以獲得顯著的抗癌治療效果[5]。 EGFR的突變主要發(fā)生在18～21外顯子序列，即酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的編碼序列，其中19和21號外顯子突變覆蓋EGFR突變的90%。EGFR-TK突變的肺癌患者應(yīng)用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)類藥物，包括厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼等[6]。EGFR-TKIs的敏感性與EGFR的突變類型密切相關(guān)，不同的突變類型可能導(dǎo)致腫瘤對同一靶向藥物具有完全不同的反應(yīng)[6]。最新研究[7]結(jié)果表明，EGFR第18、19和21號外顯子突變是NSCLC患者對EGFR-TKIs敏感的強(qiáng)關(guān)聯(lián)因子，而第20號外顯子突變則是EGFR-TKIs耐藥的原因。

本次研究發(fā)現(xiàn)，攀西地區(qū)NSCLC患者EGFR第18～21外顯子基因的總突變率為58.3%。與此前文獻(xiàn)[8～10]數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)EGFR激酶結(jié)構(gòu)域基因的突變率與華南(55/172，32%)、華東(35/118，29.7%)及全國平均(57/176，32.4%)[8, 9]突變率有顯著差異，但與相鄰的云南宣威(43/81， 53.10%)、昆明(48/86， 55.80%)[10]等地的突變率無顯著差異。上述結(jié)果表明，攀西地區(qū)NSCLC患者EGFR突變率與周邊地區(qū)突變率一致，但顯著區(qū)別于全國其他地區(qū)，具有較高的EGFR突變率。這種EGFR突變率的地域性差異暗示攀西及周邊地區(qū)可能具有更高的EGFR誘變因子，對該區(qū)域EGFR基因誘變因子的研究可能具有較高的理論價值。

攀西地區(qū)NSCLC患者EGFR-TK突變率與患者病理數(shù)據(jù)的相關(guān)性與文獻(xiàn)報道存在較多差異。Shigematsu等[11]在617例非小細(xì)胞肺癌中檢測到130例(21%)共134個EGFR-TK結(jié)構(gòu)域突變，并證明該類型突變?yōu)镹SCLC所特有，在受檢患者中EGFR- TK結(jié)構(gòu)域突變率與患者吸煙史、組織學(xué)類型、性別等均有顯著的相關(guān)性，而與患者年齡無關(guān)。與上述結(jié)果相比，本次研究中從攀西地區(qū)患者中檢測到的EGFR-TK結(jié)構(gòu)域的總突變率更高，但突變率與患者的吸煙史、組織學(xué)類型、性別無相關(guān)性，而與患者年齡有一定的相關(guān)性，這與上述研究的結(jié)果恰好相反。上述差異與EGFR突變率的地區(qū)差異一樣，反映出攀西地區(qū)具有獨特的EGFR誘變因子，EGFR的突變可能與患者種族和生活方式有關(guān)[12]，具體原因有待進(jìn)一步研究。由于樣本量的局限，本次研究中EGFR突變率與患者年齡的相關(guān)性及其與患者民族的相關(guān)性尚缺乏足夠的統(tǒng)計學(xué)支持，更準(zhǔn)確的相關(guān)性分析結(jié)果有賴于進(jìn)一步的大樣本量分析。

Kobayashi等[13]在79個存在EGFR-TK結(jié)構(gòu)域突變的腫瘤中發(fā)現(xiàn)有11個(14%)具有靶向藥物敏感型突變，適用靶向藥物治療。本次研究發(fā)現(xiàn)，在所有存在EGFR-TK結(jié)構(gòu)域突變的腫瘤中，適用靶向藥物的敏感型突變?nèi)藬?shù)僅占總突變?nèi)藬?shù)的4.8%(2/42)，與上述研究結(jié)果并無顯著差異，說明攀西地區(qū)EGFR藥物敏感型突變的發(fā)生率與其他地區(qū)一致，適于將靶向抗癌藥物應(yīng)用于具有特定基因突變的人群。

綜上所述，攀西地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變率與周邊地區(qū)一致，但高于全國其他地區(qū)。NSCLC癌組織EGFR基因18～21號外顯子突變率較高，主要突變類型為點突變、缺失突變、插入突變和插入/缺失突變等。19號外顯子基因突變情況最多，20號外顯子突變類型最復(fù)雜。6種癌癥病理相關(guān)突變中僅21號外顯子中發(fā)現(xiàn)1種靶向藥物敏感型突變。