CHFR、CDKN2A甲基化在食管鱗癌KYSE150、KYSE180細(xì)胞系放射抵抗中的作用

梅新宇 程 民 王 亮 解明然 吳顯寧

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 安徽省立醫(yī)院胸外科，安徽 合肥 230001)

目前世界上食管癌死亡率占所有腫瘤死亡率第六位〔1,2〕，亞洲國(guó)家主要病理類型為鱗狀細(xì)胞癌〔3〕。DNA甲基化為重要的表觀遺傳學(xué)改變，指的是腺嘌呤(A)或者胞嘧啶(C)的堿基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下與甲基發(fā)生共價(jià)結(jié)合的現(xiàn)象〔4〕。抑癌基因甲基化會(huì)致抑癌基因表達(dá)缺失或抑制，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，而食管鱗癌中多種調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑癌基因甲基化也是食管鱗癌形成的原因之一〔5,6〕。放射治療是臨床食管鱗癌治療的重要組成部分，放射抵抗是放療失敗或腫瘤局部復(fù)發(fā)的重要原因〔7，8〕。本研究旨在探討CHFR/CDKN2A抑癌基因的DNA甲基化在放射抵抗中的生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 食管鱗癌細(xì)胞系(KYSE150細(xì)胞、KYSE180細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫(kù))，RPMI1640 培養(yǎng)基(Thermo scientific公司)，胎牛血清(天杭生物科技公司)，胰蛋白酶(Solarbio)，二甲基亞砜(Sigma)及75%乙醇；實(shí)驗(yàn)儀器包括超凈工作臺(tái)、CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、電泳儀、流式細(xì)胞儀、超低溫冰箱、熒光定量PCR儀、平底型 96 孔培養(yǎng)板及PyroMark Q96 ID焦磷酸測(cè)序儀等。

1.2細(xì)胞輻照實(shí)驗(yàn) 將存放有食管鱗癌KYSE150，KYSE180的細(xì)胞凍存管取出，復(fù)蘇后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)的KYSE150，KYSE180細(xì)胞制作為細(xì)胞懸液，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞分別種在6孔板中，待觀察見(jiàn)細(xì)胞貼壁并狀態(tài)良好時(shí),將細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至 80%且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KYSE150，KYSE180細(xì)胞分別給予高能量 X 線(室溫下條件下由 Varian CX直線加速器 6 MV-X 線分別給予8 Gy 的 X 線照射。源距離標(biāo)本100 cm，照射野為 20 cm×20 cm，吸收劑量率為 1.50 Gy/min)。照射后，立即將其制成單細(xì)胞懸液(以0.25%胰蛋白酶消化并獲得單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù))，按照1 d、3 d、5 d、7 d 分為 4 組，平均接種于25 cm培養(yǎng)瓶中，將細(xì)胞置入 37℃、5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適當(dāng)添加培養(yǎng)液，及時(shí)換培養(yǎng)液，直至放射抵抗的細(xì)胞克隆在細(xì)胞凋亡、壞死后形成。

1.3KYSE150，KYSE180細(xì)胞及KYSE150-8 Gy和KYSE180-8 Gy細(xì)胞DNA提取及甲基化測(cè)序 細(xì)胞系樣本DNA提取，并經(jīng)亞硫酸鹽處理轉(zhuǎn)化后，采用PyroMark Assay design2.0針對(duì)CDKN2A和CHFR基因啟動(dòng)子CpG島設(shè)計(jì)PCR引物和測(cè)序引物(設(shè)計(jì)結(jié)果:CDKN2A，正義：TTGAGGAGAGGGGGAGAGTAGGT，反義：CAAACCCTCTACCCACCTAAAT。CHFR,正義：GGGGAGGGGTTAGAGGTTTTTG，反義：TTCCCCCTCCCTTCTACCCCAACA)。按PyroMark PCR Kit試劑盒(德國(guó)，Qiagen)說(shuō)明書(shū)要求完成焦磷酸測(cè)序前的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為：去離子水6 μl，混合物12.5 μl，上游引物2 μl，下游引物2 μl，CoralLoad Concentrate 2.5 μl，共25 μl。反應(yīng)條件如下：①95℃條件下預(yù)變性15 min；②94℃條件變性30 s；③56℃條件退火30 s；④72℃條件延伸30 s；⑤PCR在以上條件循環(huán)45次；⑥72℃溫度延伸10 min。DNA擴(kuò)增后將堿基、酶及底物加入容器并置入Q96或Q24儀器，在酶標(biāo)版的每根管中準(zhǔn)備預(yù)備好的微珠預(yù)混液，打開(kāi)CpG軟件進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

1.4KYSE150，KYSE180細(xì)胞及KYSE150-8 Gy和KYSE180-8 Gy細(xì)胞mRNA提取與檢測(cè) 采用氯仿處理樣本，提取樣本總RNA；按序加入RT反應(yīng)的混合物，預(yù)留一個(gè)RT反應(yīng)的量；取14 μl RT反應(yīng)的混合物加入每根Ep管中，充分混勻后短暫離心，收集產(chǎn)物；37℃，孵育50 min，70℃，RT反應(yīng)15 min后終止反應(yīng)，產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)。

1.5放射抵抗細(xì)胞系與原始細(xì)胞系細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) KYSE150、KYSE150-8 Gy、KYSE180及KYSE180-8 Gy細(xì)胞起始接種濃度為1×105/瓶，分別于1,3,5,7 d消化后計(jì)數(shù)，配對(duì)比較細(xì)胞系增殖能力。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1食管鱗癌細(xì)胞系甲基化程度 KYSE150細(xì)胞中CHFR基因甲基化程度為42.33%，放射抵抗細(xì)胞系KYSE150-8 Gy細(xì)胞中甲基化發(fā)生率為75.22%，放射抵抗細(xì)胞系CHFR基因甲基化發(fā)生率顯著高于原始細(xì)胞系(P<0.05)；而在KYSE180細(xì)胞系和放射抵抗細(xì)胞克隆KYSE150-8 Gy細(xì)胞系中發(fā)生率分別為7.36%和25.93%，放射抵抗細(xì)胞系CHFR基因甲基化發(fā)生率顯著高于原始細(xì)胞系(P<0.05)。

食管鱗癌細(xì)胞系KYSE150細(xì)胞中CDKN2A基因甲基化程度為54.59%，放射抵抗細(xì)胞系KYSE150-8 Gy細(xì)胞中甲基化發(fā)生率為85.22%，放射抵抗細(xì)胞系CDKN2A基因甲基化發(fā)生率顯著高于原始細(xì)胞系(P<0.05)；而在KYSE180細(xì)胞系和放射抵抗細(xì)胞克隆KYSE150-8 Gy 細(xì)胞系中發(fā)生率分別為12.68%和36.96%，放射抵抗細(xì)胞系CDKN2A基因甲基化發(fā)生率顯著高于原始細(xì)胞系(P<0.05)。

2.2CDKN2A及CHFR基因mRNA表達(dá) 放射抵抗的KYSE150-8 Gy，KYSE180-8 Gy細(xì)胞系中CDKN2A基因mRNA(10.070±0.026，0.122±0.072)及CHFR基因mRNA的表達(dá)(0.167±0.096，0.219±0.124)顯著低于原始的KYSE150，KYSE180細(xì)胞系(1.000，1.000，1.000，1.000)(P<0.05)。

2.3細(xì)胞增殖 KYSE150-8 Gy，KYSE180-8 Gy細(xì)胞系增殖能力顯著高于KYSE150，KYSE180細(xì)胞系(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 KYSE150、KYSE150-8 Gy、KYSE180及KYSE180-8 Gy細(xì)胞的增殖情況

3 討 論

放射治療是臨床食管鱗癌綜合治療的重要手段,影響食管鱗癌放射療效的主要因素有鱗癌組織對(duì)放射線的敏感程度及癌組織對(duì)射線的耐受程度。其中放射抵抗是導(dǎo)致放療失敗(無(wú)效)或癌腫復(fù)發(fā)的重要原因〔7，8〕。目前在對(duì)腸癌、胃癌、乳腺癌、頭頸鱗癌的研究〔9，10〕發(fā)現(xiàn)，對(duì)發(fā)生甲基化改變的基因進(jìn)行去甲基化處理可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞在射線治療時(shí)的細(xì)胞毒作用，增加對(duì)射線的敏感，減少放射抵抗。食管鱗癌抑癌基因CHFR及CDKN2A的DNA甲基化具有較高的發(fā)生率。Shibata 等〔11〕檢測(cè)了 15 個(gè)食管癌細(xì)胞系，其中TE5、TE6、TE9 和 TE14 細(xì)胞系的CHFR mRNA表達(dá)缺失。Morioka等〔12〕研究了38 例原發(fā)食管癌腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)其中23.7%(9例)發(fā)生了甲基化，而食管正常組織中均未測(cè)到甲基化發(fā)生；CDKN2A基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化在食管兩種主要病理類型即鱗狀細(xì)胞癌和腺癌中也有比較高的發(fā)生頻率〔13,14〕。放射抵抗的細(xì)胞系中CHFR及CDKN2A基因甲基化可能是導(dǎo)致食管鱗癌放射抵抗重要原因，抑癌基因失活后所致的mRNA低表達(dá)導(dǎo)致抑癌基因蛋白產(chǎn)物的缺失，繼而失去了對(duì)鱗癌細(xì)胞的抑制作用，使腫瘤的損傷修復(fù)與抗凋亡能力增強(qiáng)從而發(fā)揮了抗放射作用，這可能是導(dǎo)致食管鱗癌放射抵抗的機(jī)制之一。本文說(shuō)明放射抵抗的食管鱗癌細(xì)胞具有更為惡性的生物學(xué)行為。因此，抑癌基因CHFR及CDKN2A甲基化削弱了其生物學(xué)功能，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和干預(yù)有助于臨床預(yù)測(cè)食管鱗癌的生物學(xué)行為、放射敏感性及放射抵抗特性，也為后續(xù)食管鱗癌放射增敏方法研究奠定基礎(chǔ)。