莪術(shù)水提物通過(guò)上調(diào)notch1誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞凋亡

李浩渤 陳 勇 陳 宇

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔內(nèi)科，河北 石家莊 050000)

目前對(duì)于口腔癌的治療多采用放療配合手術(shù)等手段〔1～3〕，這些復(fù)合療法可以有效控制疾病發(fā)展，但副作用大，會(huì)對(duì)身體造成較大的負(fù)擔(dān)。老年人各項(xiàng)身體功能相對(duì)較弱，在老年階段發(fā)生口腔癌病變，復(fù)合療法的使用受到明顯的限制。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在使用過(guò)程中藥效平和，毒副作用明顯較低，在老年病、慢性病的治療上具有極大的優(yōu)勢(shì)。中國(guó)藥典記錄，姜科植物莪術(shù)具有破血行氣、消積止痛的作用〔4〕，臨床上可以作為抗腫瘤藥物，特別是抗早期宮頸癌的藥物進(jìn)行使用?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)莪術(shù)水提物及其多種有效成分對(duì)多種腫瘤有良好的抑制作用，可以直接抑制腫瘤細(xì)胞蛋白的合成〔5,6〕。本文旨在探究莪術(shù)水提物體內(nèi)外對(duì)口腔癌細(xì)胞增殖的抑制作用，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞周期及notch1基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與動(dòng)物 Tca8113口腔癌細(xì)胞，受贈(zèng)于上海交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科。KB口腔癌細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。

NCR/Nu裸鼠，雌雄各半，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，共50只，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔合格證號(hào)：SCXK(冀)20012-1-003〕。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑、儀器與藥物 RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS，Gibco)，凋亡試劑盒(四正柏)，Trizol(Life Technology)，逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒(Thermo)，培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等細(xì)胞實(shí)驗(yàn)耗材(Corning)。普通化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(天津大茂)。 超凈工作臺(tái)(蘇州蘇凈)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞恒)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)，熒光定量PCR儀(ABI)，冷凍高速離心機(jī)(Thermo)，流式細(xì)胞儀(貝克曼)，分析天平(梅特勒)。莪術(shù)購(gòu)于北京同仁堂，使用5倍體積蒸餾水煎煮，沸后1 h停止，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥量為5 g/ml。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇口腔癌Tca8113和KB細(xì)胞株，從液氮中取出細(xì)胞后，置于37℃水浴鍋中搖動(dòng)迅速解凍，1 000 r/min，3 min離心后，使用新鮮的RPMI1640含有10%FBS重懸細(xì)胞，并接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶。待細(xì)胞生長(zhǎng)置大部分鋪滿培養(yǎng)瓶，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓后，加入培養(yǎng)液終止消化，離心去除培養(yǎng)液加入新鮮培養(yǎng)液重懸，并傳代于新的培養(yǎng)瓶中。凍存如傳代，在離心去除培養(yǎng)液后使用含有10%FBS和10%二甲基亞砜(DMSO)的RPMI1640培養(yǎng)液重懸，加入凍存管并置于梯度凍存盒內(nèi)，1 d后存于液氮。

1.4MTT法檢測(cè)口腔癌細(xì)胞的增殖 取傳1代的口腔癌細(xì)胞Tca8113和KB，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104，接種于96孔板中，每孔100 μl。12 h后，棄去細(xì)胞上清液，并加入配置好的含有0,1.25，2.50和5.00 μg/ml的莪術(shù)水提物的培養(yǎng)液。加入藥物培養(yǎng)20 h后，加入10 μl MTT，4 h后使用酶標(biāo)儀在570 nm處讀取吸光度，計(jì)算抑制率。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)口腔癌細(xì)胞的凋亡 取傳1代的口腔癌細(xì)胞Tca8113，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，接種于6孔板中，每孔1 000 μl。12 h后，棄去細(xì)胞上清液，并加入配置好的含有0,1.25，2.50和5.00 μg/ml的莪術(shù)水提物的培養(yǎng)液。孵育24 h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗離心，并加入70%的酒精固定細(xì)胞，按照凋亡試劑盒說(shuō)明書分別加入PI及Annexin V-FITC染色細(xì)胞后，4℃保存直至上機(jī)檢測(cè)。

1.6Q-PCR法檢測(cè)口腔癌細(xì)胞notch1基因的表達(dá) 取傳1代的口腔癌細(xì)胞Tca8113，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，接種于6孔板中，每孔1 000 μl。12 h后，棄去細(xì)胞上清液，并加入配置好的含有0,1.25，2.50和5.00 μg/ml的莪術(shù)水提物的培養(yǎng)液。孵育24 h后，每孔加入1 ml Trizol，按照試劑盒說(shuō)明書中的方法提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照Thermo Q-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行notch1基因表達(dá)檢測(cè)。notch1引物：5′-ATCACTGCCCAGGAAACAAC-3′和5′-GTCCAGCCATTGACACACAC-3′。擴(kuò)增條件為95℃，15 min；94℃，15 s；60℃，25 s；72℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)使用2-△△Ct法分析。

1.7NCR/Nu小鼠腫瘤模型制備與給藥 取傳1代生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，使用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度置1×107個(gè)/ml。除對(duì)照組裸鼠外，使用酒精棉消毒裸鼠右前肢皮膚，按照0.2 ml/只接種裸鼠。每天觀察腫瘤發(fā)生情況，排除未生長(zhǎng)腫瘤小鼠9只，剩余小鼠隨機(jī)分為模型組(7只)，莪術(shù)水提物低、中和高劑量組各8只。待腫瘤生長(zhǎng)至3～6 mm時(shí)，莪術(shù)水提物低、中和高劑量組分別灌胃25，50和100 mg/kg藥物，對(duì)照和模型組灌胃等量蒸餾水，共給藥5 w。

1.8腫瘤體積和質(zhì)量測(cè)定 于末次給藥1 h后處死小鼠，分離腫瘤組織。使用千分之一游標(biāo)卡尺檢測(cè)分離皮下移植瘤的長(zhǎng)直徑(a)和短直徑(b)，計(jì)算腫瘤體積和抑制率。腫瘤體積=ab2/2，體積抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積/對(duì)照組腫瘤體積)×100%。測(cè)量完成后，使用清潔濾紙擦干凈血跡，使用分析天平稱重，計(jì)算腫瘤抑制率。質(zhì)量抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量/對(duì)照組腫瘤質(zhì)量)×100%。

1.9Q-PCR法測(cè)定腫瘤組織notch1基因的表達(dá) 分離得到的腫瘤組織稱重完成后，剪取100 mg置Trizol試劑內(nèi)，按照試劑盒說(shuō)明方法提取RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。notch1引物：5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′和5′-CATGGGATATGACTGCTC-3′。擴(kuò)增條件為95℃，15 min，94℃，15 s；60℃，25 s；72℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)使用2-△△Ct法分析。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS21.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1莪術(shù)水提物對(duì)口腔癌細(xì)胞Tca8113和KB增殖的影響 與對(duì)照組比較，莪術(shù)水提物低、中、高劑量組Tca8113細(xì)胞的吸光度明顯下降(P<0.05或P<0.01)，其抑制率分別為26.21%，42.89%和54.02%。與對(duì)照組比較，莪術(shù)水提物高劑量組KB細(xì)胞的吸光度明顯下降(P<0.05)，其抑制率為19.18%。莪術(shù)水提物低、中劑量組KB細(xì)胞抑制率分別為10.10%、11.35%。見(jiàn)表1。

表1 莪術(shù)水提物對(duì)口腔癌細(xì)胞Tca8113和KB的抑制率吸光度A值，n=3)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2莪術(shù)水提物對(duì)口腔癌細(xì)胞Tca8113凋亡的影響 與對(duì)照組〔(2.51±0.02)%〕比較，莪術(shù)水提物高劑量組的口腔癌Tca8113細(xì)胞凋亡率明顯增加〔(8.78±1.01)%，P<0.05〕，莪術(shù)水提物低、中劑量組凋亡率分別為〔(2.13±0.24)%，(4.72±1.90)%〕，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3莪術(shù)水提物對(duì)口腔癌細(xì)胞notch1基因表達(dá)的影響 與模型組(1.010±0.038)比較，莪術(shù)水提物中、高劑量組的notch1基因表達(dá)明顯增加(1.337±0.101，1.477±0.108；P<0.05)。莪術(shù)水提物低劑量組notch1基因表達(dá)量為1.123±0.044，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4莪術(shù)水提物對(duì)口腔癌細(xì)胞Tca8113移植瘤小鼠在體腫瘤體積和質(zhì)量的影響 與對(duì)照組比較，模型組的腫瘤體積和質(zhì)量明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，莪術(shù)水提物中、高劑量組的腫瘤體積明顯下降(P<0.05)，對(duì)腫瘤體積的抑制率分別為25.42%和46.65%；與模型組比較，莪術(shù)水提物中、高劑量組的腫瘤質(zhì)量明顯下降(P<0.05)，對(duì)腫瘤質(zhì)量的抑制率分別為27.01%和42.98%。莪術(shù)水提物低劑量組對(duì)腫瘤體積的抑制率為7.07%，對(duì)腫瘤質(zhì)量的抑制率為7.01%。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠在體腫瘤的體積和質(zhì)量

2.5莪術(shù)水提物對(duì)口腔癌細(xì)胞Tca8113移植瘤小鼠notch1基因表達(dá)的作用 與對(duì)照組(1.010±0.038)相比，模型組notch1基因表達(dá)明顯下降(0.643±0.017，P<0.01)。與模型組比較，莪術(shù)水提物中、高劑量組的notch1基因表達(dá)明顯增加(0.698±0.091，0.747±0.075；P<0.05)。莪術(shù)水提物低劑量組nothch1基因表達(dá)量為0.662±0.013，與對(duì)照組及模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生和氣滯血瘀證有關(guān)，活血化瘀類藥物對(duì)于治療癌癥有著重要的作用〔7〕。莪術(shù)被證實(shí)是一種具有抗腫瘤作用的中藥〔8,9〕，本研究對(duì)莪術(shù)抗口腔鱗狀細(xì)胞瘤的作用進(jìn)行了研究。

notch1基因在腫瘤的發(fā)生中表現(xiàn)出多種不同的作用，在不同的細(xì)胞類型和環(huán)境中，notch1基因可能出現(xiàn)促癌和抑癌的不同效果。有研究表明，notch1基因在皮膚癌、小細(xì)胞肺癌等癌癥中可以作為抑癌基因存在，notch1基因上調(diào)可以起到誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖的作用〔10,11〕。而在口腔癌組織樣本中，notch1基因的表達(dá)顯著性降低，因此增強(qiáng)notch1基因的表達(dá)、促進(jìn)口腔癌細(xì)胞凋亡是口腔癌治療的途徑之一。本研究首先探討了莪術(shù)水提物體外抑制口腔癌細(xì)胞株Tca8113和KB的作用，發(fā)現(xiàn)其對(duì)不同的細(xì)胞株作用效果不同，對(duì)Tca8113效果更強(qiáng)，提示莪術(shù)在臨床應(yīng)用時(shí)需要對(duì)癥試藥。因此，在之后進(jìn)行莪術(shù)水提物對(duì)細(xì)胞凋亡及notch1基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇了Tca8113細(xì)胞進(jìn)行深入研究。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，莪術(shù)水提物可以誘導(dǎo)該種口腔癌細(xì)胞凋亡，并且能夠起到在體抑制Tca8113細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的作用。同時(shí)，體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)，莪術(shù)水提物可以上調(diào)notch1基因的表達(dá)，這是莪術(shù)水提物抑制口腔癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制之一。本研究結(jié)果證實(shí)，莪術(shù)水提物具有體內(nèi)外抑制口腔鱗狀細(xì)胞瘤的作用，而該作用與notch1基因表達(dá)的抑制有關(guān)。