基因C677T多態(tài)性在2型糖尿病合并大血管病變中的意義

王金輝 王飛飛 李為民

[摘要] 目的 探討MTHFR基因C677T突變與2型糖尿?。═2DM）合并大血管病變的關(guān)系。 方法 納入2015年10月～2017年1月哈爾濱市第一醫(yī)院380例T2DM患者（其中218例單純T2DM患者和162例T2DM大血管并發(fā)癥患者）和306例健康對(duì)照者。分離血液基因組DNA，采用基于聚合酶鏈反應(yīng)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法對(duì)MTHFR基因C677T突變進(jìn)行基因分型。 結(jié)果 與單純T2DM患者相比，T2DM合并大血管并發(fā)癥患者M(jìn)THFR基因C677T突變的TT基因型和T等位基因型頻率顯著增高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）?；蛐蚑T患者同型半胱氨酸濃度明顯高于基因型CT和CC的患者（P < 0.05、P < 0.01）。 結(jié)論 T2DM合并大血管病變可能與MTHFR基因C677T突變有一定相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 糖尿??；大血管病變；亞甲基四氫葉酸還原酶；C677T突變；基因型；同型半胱氨酸

[中圖分類號(hào)] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）05（b）-0102-05

The significance of C677T mutation in type 2 diabetes mellitus combined with macrovascular complications

WANG Jinhui1 WANG Feifei1 LI Weimin2

1.Department of Laboratory Medicine， the First Hospital of Harbin， Heilongjiang Province， Harbin 150000， China； 2.Department of Cardiology， the First Hospital of Harbin， Heilongjiang Province， Harbin 150000， China

[Abstract] Objective To investigate the possible association between MTHFR gene C677T mutation and type 2 diabetes mellitus （T2DM） combined with macrovascular complications. Methods Clinical data of 380 T2DM patients （218 simple T2DM and 162 T2DM patients with macrovascular complications） and 306 healthy controls were selected from the First Hospital of Harbin from October 2015 to January 2017. Blood genomic DNA was separated and the polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） assay was used for genotyping of the MTHFR gene C677T mutation. Results The frequencies of TT genotypes and T alleles of the C677T mutation in MTHFR gene in T2DM patients with macrovascular complications were statistically significantly higher than those of simple T2DM patients （P < 0.01）. The homocysteine level in genotypic TT patients was significantly higher than that of genotype CT and CC patients （P < 0.05， P < 0.01）. Conclusion The combination of T2DM with macroangiopathy may be related with the mutation of the MTHFR gene C677T.

[Key words] Diabetic mellitus； Macrovascular complications； Methylenetetrahydrofolate reductase； C677T mutation； Genotype； Homocysteine

糖尿病是21世紀(jì)最重要的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一。過去十年，它作為全球健康威脅的疾病被大家所忽視。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）稱，中國是2015年全球糖尿病患者人數(shù)最多的國家，約有1.1億人患有糖尿病[1]。糖尿病是可以引起各個(gè)系統(tǒng)并發(fā)癥的最常見的非傳染性疾病，導(dǎo)致感覺、運(yùn)動(dòng)和/或自主神經(jīng)功能障礙[2-3]。根據(jù)近期的研究，人們普遍認(rèn)為，糖尿病患者顯著增加了血管疾病的易感性，2型糖尿?。═2DM）的危害主要來自血管并發(fā)癥[4]。有研究表明，血管病變是糖尿病患者死亡的主要原因，約占糖尿病死亡率的65%[5]。大血管并發(fā)癥是T2DM的重要威脅，其中包括冠心病、中風(fēng)和外周動(dòng)脈疾病[6]。同時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸水平的升高是糖尿病血管病變的危險(xiǎn)因素[7]。此外，據(jù)報(bào)道，糖尿病患者中高同型半胱氨酸血癥與冠狀動(dòng)脈性心臟病的發(fā)病率有關(guān)[8-9]。

亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是葉酸途徑的重要酶，其催化同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸，通過同型半胱氨酸的重新甲基化過程間接為DNA甲基化和蛋白質(zhì)甲基化提供甲基并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一個(gè)較低的水平[10]。本研究決定收集哈爾濱市第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）相關(guān)患者，探討MTHFR基因C677T多態(tài)性與T2DM合并大血管病變的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究收集2015年10月～2017年1月我院臨床實(shí)驗(yàn)室登記的380例T2DM患者，其中單純T2DM患者218例，男92例，女126例，平均年齡（51.25±4.32）歲；伴有血管并發(fā)癥的T2DM患者162例，男66例，女96例，平均年齡（56.14±3.12）歲。患者均符合世界衛(wèi)生組織的糖尿病標(biāo)準(zhǔn)（2型）。依據(jù)1997年美國糖尿病協(xié)會(huì)（ADA）修改的糖尿病診斷新標(biāo)準(zhǔn)[11]，本研究中的大血管并發(fā)癥包括冠狀動(dòng)脈功能不全、腦動(dòng)脈功能不全、冠心病、腦梗死、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭和高血壓。所有的大血管并發(fā)癥均得到心血管專家的診斷和確認(rèn)。共招募了同期健康受試者306名，男124名，女182名，平均年齡（50.16±3.46）歲。健康對(duì)照組人員的年齡和地理區(qū)域與2型糖尿病患者相匹配，并且沒有其他全身性疾病。三組研究對(duì)象性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。研究對(duì)象的各項(xiàng)指標(biāo)都是采用標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)室方法測(cè)量。參與研究者已簽署知情同意書，且研究方案由我院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

使用DNA分離試劑盒（Tiangen，China）按照說明書方法從全血樣品中提取基因組DNA。通過基于PCR的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）測(cè)定方法分析MTHFR基因C677T多態(tài)性[11]。簡(jiǎn)而言之，使用G6高保真DNA聚合酶（HaiGene，China）通過擴(kuò)增基因組DNA獲得539 bp的PCR產(chǎn)物，引物序列為5′-CAG AGC ACT CTC TCT GCC CAG T-3′和5′-CCC TTT TGG TGA TGC TTG TTG GCC-3′。然后，將539 bp的PCR產(chǎn)物用HinfI（New England BioLabs Inc.，British）限制酶在37℃下消化過夜，消化產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上分離。PCR片段用溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。野生型（CC）的只有539 bp，雜合子（CT）有3個(gè)條帶，366、173 bp和539 bp，純合突變型（TT）有366 bp和173 bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用JMP5.1（SAS Windows版本）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用χ2檢驗(yàn)評(píng)估患者和對(duì)照基因型分布的Hardy-Weinberg平衡，并用于分析C677T突變與T2DM患者大血管并發(fā)癥之間的關(guān)系。通過ANOVA統(tǒng)計(jì)分析患者的臨床特征，運(yùn)用LSD-t檢驗(yàn)對(duì)三組間進(jìn)行兩兩比較，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR C677T突變與T2DM大血管并發(fā)癥顯著性相關(guān)

采用PCR-RFLP測(cè)定C677T突變基因分型，三種基因型見圖1。運(yùn)用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析顯示，T2DM合并大血管組TT基因型和T等位基因頻率顯著性高于單純T2DM組（P < 0.01）。見表1。

2.2 TT基因型患者的同型半胱氨酸水平顯著升高

除同型半胱氨酸以外，三種基因型CC、CT和TT之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）?；蛐蚑T患者同型半胱氨酸濃度明顯高于基因型CT和CC（P < 0.05、P < 0.01）。見表2。

3討論

研究表明MTHFR基因C677T多態(tài)性與T2DM合并大血管病變有很密切的相關(guān)性[12-13]，同時(shí)一些研究顯示相反的結(jié)果[14-15]，這表明MTHFR基因C677T多態(tài)性與T2DM合并大血管病變之間的關(guān)聯(lián)是存在爭(zhēng)議的。在本研究中，MTHFR基因C677T突變與2型糖尿病大血管并發(fā)癥間存在一定的關(guān)系。此外，大血管并發(fā)癥的T2DM患者C677T突變的基因型和等位基因頻率和單純糖尿病之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P = 0.008、0.002），提示MTHFR基因C677T等位基因可能會(huì)增加T2DM糖尿病伴大血管并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)于大血管并發(fā)癥，心血管疾?。–VD）是T2DM患者死亡的主要原因[6]，T2DM患者的卒中風(fēng)險(xiǎn)比普通人群高3倍[16]。在以前的研究中，T2DM伴大血管病變患者血漿同型半胱氨酸總濃度和高半胱氨酸血癥發(fā)生頻率明顯升高，并且同型半胱氨酸是大血管并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[17]。此外，據(jù)報(bào)道，高同型半胱氨酸與冠心病（CHD）之間存在極強(qiáng)的相關(guān)性，提示同型半胱氨酸可能是CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[18]。此外，還發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸水平與冠狀動(dòng)脈狹窄的嚴(yán)重程度相關(guān)[19]。眾所周知，MTHFR中C677T突變是影響血漿高同型半胱氨酸水平的因素[20]。具有TT基因型患者的血漿同型半胱氨酸水平顯著高于具有CT和CC基因型的患者[21]。本研究中提示，MTHFR基因C677T多態(tài)性與T2DM大血管并發(fā)癥之間存在顯著的關(guān)系。MTHFR基因C677T突變也被證實(shí)與糖尿病伴冠狀動(dòng)脈心臟病、左心室肥厚、高同型半胱氨酸和缺血性卒中密切相關(guān)[22]。高同型半胱氨酸可以通過降低一氧化氮的生物利用度[23-24]，改變各種血栓形成因子的表達(dá)，促進(jìn)動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞有絲分裂或急性應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙[25]。此外，高同型半胱氨酸可以刺激血管平滑肌細(xì)胞增生，進(jìn)一步損害凝血和纖維蛋白溶解系統(tǒng)，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，增加冠心病和腦梗死等心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。其次，血管平滑肌細(xì)胞在高同型半胱氨酸的影響下可導(dǎo)致其加速早期動(dòng)脈粥樣硬化炎性反應(yīng)[26]。第三，升高的循環(huán)同型半胱氨酸濃度可使血管閉塞風(fēng)險(xiǎn)增加?？傊?，本研究結(jié)果提示，MTHFR基因C677T多態(tài)性與T2DM大血管并發(fā)癥之間存在一定的關(guān)系。

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（收稿日期：2017-12-04 本文編輯：張瑜杰）