Peutz?Jeghers綜合征惡性腫瘤相關(guān)的STK11基因突變分析

王媛媛 鄧秀金 陳靜 馮潔 吳保平 王志青

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院1腫瘤科，2消化科（廣州 510515）

Peutz?Jeghers綜合征（Peutz?Jeghers syndrome，PJS，MIM#175200），亦稱(chēng)黑斑息肉綜合征，是一種以胃腸道多發(fā)錯(cuò)構(gòu)瘤樣息肉、皮膚黏膜色素沉著為特征，并具高度腫瘤易感性的罕見(jiàn)常染色體顯性遺傳病［1］?；颊卟粌H胃腸道息肉可惡變，還可伴發(fā)胃腸道外許多器官的惡性腫瘤，包括肝臟、胰腺、肺及婦科腫瘤等［2］。PJS息肉可累及消化道任何部位，手術(shù)無(wú)法進(jìn)行根治［3］，患者可能同時(shí)并發(fā)多種腫瘤［4］且發(fā)生惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)是普通人群的9～18倍［5］，中國(guó)PJS患者還表現(xiàn)出較嚴(yán)重的癌癥擔(dān)憂(yōu)［6］，嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量。因此，尋找惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)的預(yù)警信號(hào)非常重要。抑癌基因STK11（serine threonine kinase 11，MIM#602216）基因突變被認(rèn)為是PJS的致病原因［7］，由9個(gè)外顯子組成，編碼區(qū)為1 302 bp，編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶STK11。目前已發(fā)現(xiàn)STK11基因致病突變300余種，但突變類(lèi)型和惡性腫瘤的關(guān)系尚無(wú)定論。

本研究將以2個(gè)惡性腫瘤高發(fā)的PJS家系作為研究對(duì)象，報(bào)道一種可能與PJS惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)的STK11基因突變類(lèi)型，為PJS家系進(jìn)行惡性腫瘤的提前預(yù)警、監(jiān)測(cè)及隨訪(fǎng)提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料在廣東省廣州市南方醫(yī)院腫瘤科病房和消化科門(mén)診采集到2個(gè)PJS家系（圖1），分別來(lái)自廣東?。▓D1A）和福建?。▓D1B），共調(diào)查9例患者的臨床病理資料，其中6例患者和10例家系中健康成員提供外周血標(biāo)本。研究中PJS患者均符合以下4條中的任何1條［8］：（1）2個(gè)或多個(gè)息肉，經(jīng)組織學(xué)診斷符合PJS特點(diǎn)，即起源于黏膜肌層的平滑肌像樹(shù)枝樣延伸至息肉的黏膜下層；（2）具有PJS家族史且伴有任何數(shù)量的PJ息肉；（3）具有PJS家族史且有典型的皮膚黏膜色素沉著；（4）典型的皮膚黏膜色素沉著且伴有任何數(shù)量的PJ息肉。另外取100例無(wú)親緣關(guān)系的健康人作為正常對(duì)照。本次研究遵循知情同意的原則，并取得南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

圖1 2個(gè)發(fā)生惡性腫瘤的Peutz?Jeghers綜合征家系圖譜（*表示提供外周血標(biāo)本）Fig.1 Pedigree of the PJSfamily associated with carcinomas（Participants in the DNA analysis are marked with an asterisk）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外周血DNA提取取2個(gè)家系中PJS患者和健康成員外周血樣本16份及100例家系外健康人靜脈血，采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司SK1261試劑盒提取外周血DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件對(duì)STK11基因9個(gè)外顯子及側(cè)翼序列進(jìn)行PCR，引物由廣州瑞真生物公司合成，引物序列、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)參考文獻(xiàn)［9］。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度。

1.2.3 DNA測(cè)序PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序，結(jié)果采用SequenceScanner 1.0軟件（Applied Biosystems）進(jìn)行分析并與UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//genome.ucsc.edu/）中的STK11基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 MLPA分析MLPA試劑盒SALSA P101?B1 STK11購(gòu)自MRC?Holland公司，按照試劑盒操作說(shuō)明完成MLPA反應(yīng)［10］。MLPA反應(yīng)產(chǎn)物用ABI3500DX測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，結(jié)果采用MRC?Holland公司開(kāi)發(fā)的MLPA數(shù)據(jù)分析專(zhuān)用軟件Coffalyser進(jìn)行分析?？截悢?shù)根據(jù)電泳峰面積比值進(jìn)行判定：正常2拷貝的比值比參考范圍為0.85～1.15，比值比0.35～0.65判斷為雜合缺失突變，比值比1.35～1.65判斷為雜合重復(fù)突變。

表1 PJS患者臨床特征及惡性腫瘤發(fā)生情況Tab.1 Characteristics of affected individuals in two Chinese PJSfamilies

2 結(jié)果

2.1 PJS患者臨床特征及惡性腫瘤發(fā)生情況2個(gè)家系中9例PJS患者臨床特征見(jiàn)表1。分析發(fā)現(xiàn)PJS患者惡性腫瘤發(fā)生率為44.4%（4/9），發(fā)生惡性腫瘤的平均年齡為38.8歲（29～50歲），其中，家系1患者Ⅲ：3在30和44歲時(shí)發(fā)生2種不同的惡性腫瘤，分別為卵巢癌和小腸腺癌。此外，患者Ⅳ：1于28歲時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸一直徑約3 cm的巨大錯(cuò)構(gòu)瘤性息肉已發(fā)生腺瘤樣變，并伴有中重度不典型增生。

2.2 PJS家系STK11基因突變分析應(yīng)用Sanger測(cè)序檢測(cè)STK11基因突變，在2個(gè)PJS家系的患者中均未發(fā)現(xiàn)任何變異。隨后應(yīng)用MLPA技術(shù)檢測(cè)大片段重復(fù)或缺失，在這兩個(gè)無(wú)親緣關(guān)系的家系中，兩位先證者均發(fā)現(xiàn)STK11基因第一號(hào)外顯子（Exon1）缺失突變c.-1114-?_290+?del（圖2）。

進(jìn)一步MLPA驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)PJS家系中，所有患者均檢測(cè)到該缺失突變，而家系中表型正常的成員和健康對(duì)照者未檢出該突變，因此該突變?cè)趦蓚€(gè)PJS家系中呈現(xiàn)基因型-表型共分離。同時(shí)，生物信息學(xué)分析提示該突變可能會(huì)嚴(yán)重影響STK11基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，降低STK11激酶活性。由此推測(cè)，STK11基因Exon1缺失突變c.-1114-?_290+?del是導(dǎo)致患者出現(xiàn)PJS臨床表現(xiàn)的致病性突變，而非基因多態(tài)性，且研究家系中惡性腫瘤高發(fā)可能與Exon1缺失突變密切相關(guān)。

圖2 STK11基因MLPA檢測(cè)結(jié)果（紅色箭頭指示缺失的Exon1 3個(gè)探針位置）Fig.2 MLPA analysis of STK11 gene（Red arrows mark the deleted Exon 1，three probes）

3 討論

PJS惡性腫瘤嚴(yán)重威脅患者的生命健康，國(guó)外研究表明［11-12］PJS患者病死率高達(dá)32%，惡性腫瘤是導(dǎo)致死亡的主要原因；惡性腫瘤發(fā)生率為19%～32%，平均年齡42～45歲，以胃腸道腫瘤（51%～69%）為主，其次為婦科腫瘤（22%～26%），消化道惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)是普通人群的50倍。日前報(bào)道PJS患惡性腫瘤的最小年齡為13歲，為小腸腺癌［13］。本研究中2個(gè)中國(guó)PJS家系惡性腫瘤發(fā)生率高，9例PJS患者中4例患癌，1例患者腸道息肉已發(fā)生上皮內(nèi)瘤變，且發(fā)生年齡較輕，可見(jiàn)，PJS惡性腫瘤已成為危害患者健康的主要問(wèn)題，也是臨床醫(yī)生和科研工作者最為關(guān)注的問(wèn)題。然而，該疾病中，研究STK11基因型和表型關(guān)系是焦點(diǎn)。

迄今，STK11基因的突變類(lèi)型、突變位點(diǎn)與PJS患者發(fā)生惡性腫瘤的關(guān)系仍不清楚。國(guó)外研究者先后報(bào)道STK11基因第三號(hào)外顯子突變、第六號(hào)外顯子突變、羧基端和ⅥB～Ⅷ功能區(qū)的錯(cuò)義突變與惡性腫瘤相關(guān)［14-16］，本研究組曾報(bào)道XI功能區(qū)突變可能與PJS錯(cuò)構(gòu)瘤發(fā)生上皮內(nèi)瘤變有關(guān)［10］。而本次研究中值得注意的是，在惡性腫瘤高發(fā)的2個(gè)獨(dú)立的PJS家系中同時(shí)發(fā)現(xiàn)STK11基因Exon1缺失突變，提示這一突變不僅是患者出現(xiàn)PJS臨床表現(xiàn)的致病性突變，還可能與惡性腫瘤密切相關(guān)。有趣的是，意大利學(xué)者RESTA等［17］曾報(bào)道一個(gè)PJS家系攜帶STK11基因Exon1基因缺失突變，且其中1例患者43歲時(shí)患乳腺癌，另有研究提示STK11基因可能通過(guò)影響HER?2蛋白表達(dá)而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生［18］。這些結(jié)果印證了本研究報(bào)道的STK11基因一號(hào)外顯子缺失突變對(duì)PJS的致病性以及與惡性腫瘤的相關(guān)性，但仍然需要更多國(guó)內(nèi)外PJS患者進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論。

STK11在機(jī)體內(nèi)通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抑癌作用，主要由N-末端核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)域、高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域以及C-末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域組成，其激酶催化區(qū)域位于第44-309位氨基酸殘基。本研究報(bào)道的STK11基因Exon1缺失突變c.-1114-?_290+?del，可能會(huì)影響STK11基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，降低STK11激酶活性；也可能通過(guò)干擾其與STRAD和MO25結(jié)合形成復(fù)合體，破壞STK11激酶活化功能；還可能通過(guò)阻礙AMPK、MAPK等信號(hào)通路或通過(guò)影響多種與腫瘤發(fā)生相關(guān)的蛋白如p53、Cdc37、Hsp90、PTEN與STK11的相互作用［15］，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、細(xì)胞極性和能量代謝［19］，最終導(dǎo)致PJS患者息肉形成甚至惡性腫瘤發(fā)生。我們將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討STK11基因Exon1缺失突變的致病及致癌機(jī)制，從而為PJS疾病的精確診療提供新的有效途徑。

總之，本研究聯(lián)合應(yīng)用Sanger測(cè)序和MLPA檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)中國(guó)PJS家系共有的STK11基因致病性突變，即Exon1缺失突變c.-1114-?_290+?del，且該突變很可能與PJS惡性腫瘤密切相關(guān)，為PJS家系進(jìn)行遺傳咨詢(xún)、產(chǎn)前診斷［20］以及惡性腫瘤預(yù)警、監(jiān)測(cè)和隨訪(fǎng)提供了新的理論依據(jù)。