二甲雙胍對小鼠睪丸間質(zhì)細胞的體外抑制作用及其機制研究

李蕊秀 趙昍朋 劉婧 吳家棟 何瑞平 岳鑫 張傳領 肖瑞

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學1內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理學重點實驗室，2藥學院（呼和浩特010059）

不孕不育是一個嚴峻的問題，受到社會廣泛關注。據(jù)統(tǒng)計，15%的育齡夫婦都受此問題困擾，這其中約有50%的不孕不育因素與男性有關［1］。男性不育癥是一種由多因素引起的疾病，臨床表現(xiàn)一般為精液中精子密度低以及由于精子發(fā)生異常導致精液中無精子細胞存在［2］。精子發(fā)生是一個復雜的過程，它依賴并受控于睪丸中存在的多種類型的生殖細胞。睪丸支持細胞、睪丸間質(zhì)細胞以及發(fā)育中的生殖細胞密切合作，保證精子發(fā)生正常運行，產(chǎn)生成熟的精子使卵母細胞受精［3］。

二甲雙胍屬于胰島素增敏劑，是供給2型糖尿病患者一線口服治療的人工合成制劑［4］。由于其降糖作用明顯且副作用較小，目前已在臨床上應用超過50年，現(xiàn)在全世界范圍內(nèi)每天有超過1億的糖尿病患者在服用二甲雙胍［5］。最近幾年，人們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍還有很多其他作用。例如，KATO等［6］稱二甲雙胍可抑制腫瘤細胞的增殖能力；CREANGA等［7］發(fā)現(xiàn)二甲雙胍聯(lián)合克羅米芬可通過誘導排卵改善多囊卵巢綜合征婦女的生育能力；BERTOLDO等［8］指出二甲雙胍不僅具有降血糖作用，它還可以作用于包括生殖系統(tǒng)在內(nèi)的多種人體組織。

對于糖尿病男性患者來說，睪丸組織的氧化損傷以及雄激素分泌障礙可能會不可逆地影響精子發(fā)生，進而導致精子質(zhì)量下降，并直接或間接導致男性不育［9］。目前有關二甲雙胍與男性生殖的相關研究很少。因此，有必要去研究二甲雙胍對男性生殖系統(tǒng)的影響，評估其潛在的有害或有益的價值。本研究利用體外培養(yǎng)的TM3細胞，研究二甲雙胍對細胞增殖、周期和凋亡的影響，以及相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑甲福明鹽酸鹽（二甲雙胍）購自Sigma公司，噻唑蘭（MTT）購自北京chembase科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京TransGen生物技術(shù)有限公司，熒光定量試劑盒購自北京TransGen生物技術(shù)有限公司，SDS?PAGE凝膠試劑盒購自江蘇Beyotime生物技術(shù)研究所，Annexin V?FITC/PI凋亡試劑盒購自BD公司，馬血清購自HyClone公司，DMEM/F12細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司。小鼠睪丸間質(zhì)細胞（TM3）購于上海中科院細胞庫。

1.2 MTT法檢測二甲雙胍對TM3細胞體外增殖的影響常規(guī)消化法收集處在對數(shù)生長期的TM3細胞沉淀并計數(shù)，調(diào)整細胞懸液濃度后使96孔板中每孔接種的細胞數(shù)約為1×104個/孔。次日待細胞貼壁依次分別加入含有不同濃度二甲雙胍（0、2.5、5、7.5、10 mmol/L）的培養(yǎng)基，每組設5個復孔，待三張孔板分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，避光條件下每孔加入20μL MTT孵育4 h后棄去上清，每孔加入150μL DMSO，置于震蕩器上避光低速振蕩10 min，用酶標儀測定各孔在490 nm波長處的吸光度并計算細胞抑制率：細胞抑制率（%）=［（對照孔OD值-實驗孔OD值）/（對照孔OD值-空白孔OD值）］×100%。

1.3 流式細胞術(shù)檢測二甲雙胍對細胞凋亡的影響將TM3細胞用常規(guī)消化法收集，按細胞數(shù)為2×105個/孔接種于6孔板中。次日按照半抑制濃度6.7 mmol/L加入二甲雙胍配制成實驗組培養(yǎng)基，對照組與實驗組各孔分別加入各自的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集細胞沉淀用預冷PBS洗滌。按照調(diào)亡試劑盒的說明向每管加入相應比例1×Binding buffer、Annexin V?FITC、PI并振蕩混勻，室溫下避光孵育15 min。1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測，計算活細胞、早/晚期調(diào)亡細胞的百分率。

1.4 流式細胞術(shù)檢測二甲雙胍對細胞周期的影響常規(guī)消化法收集TM3細胞，按細胞數(shù)為2×105個/孔接種于6孔板中。待細胞貼壁棄去原培養(yǎng)基，對照組與實驗組各孔分別加入各自的培養(yǎng)基繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h后，收集細胞沉淀。用預冷的PBS洗滌并重懸細胞，加入70%乙醇4℃固定過夜。次日棄去固定液并用預冷的PBS洗滌，加入0.5 mL PI/RNase Staining Buffer重懸細胞，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，在室溫下避光孵育15 min；1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測，用Modifit軟件分析各細胞周期的比例。

1.5 細胞RNA提取和熒光定量PCRTrizol法提取TM3細胞總RNA，以1 000 ng總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板，依照TransGen熒光定量試劑盒說明書，用7500 fast熒光定量PCR儀（美國AB公司）進行檢測。反應體系：TransStart Top Green qPCR SuperMix（2×）10μL，Passive Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，ddH2O 6.8μL，上下游引物各0.4μL，cDNA 2μL。反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。PCR引物見表1，以GAPDH作為內(nèi)參。用2-△△CT法分析結(jié)果。

1.6 Western blot細胞總蛋白提取后，用BCA定量試劑盒測定蛋白濃度。調(diào)整濃度為20 ng，按1∶1的比例加入2×SDS上樣緩沖液，95℃5 min后立即冰浴，10%SDS?PAGE凝膠上樣 20 μL，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉，一抗（AMPK：1∶2 000、P?AMPK 1∶1 000、α?tubulin 1∶2 000），搖勻儀上4℃孵育過夜。室溫孵育與一抗相對應的二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 1∶2 000稀釋）1 h，TBST洗滌2次，每次15 min；最后1次用TBS洗滌10 min。取出NC膜，在避光條件下將其置于Odessey CLX紅外激光成像系統(tǒng)，掃描并觀察結(jié)果。

表1 基因引物信息Tab.1 Gene primer information

1.7 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)以s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，兩組樣本均數(shù)比較行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測二甲雙胍對TM3細胞體外增殖能力的影響TM3細胞經(jīng)不同濃度的二甲雙胍（2.5、5、7.5、10 mmol/L）干預48 h后，細胞活性分別為81.68±1.54、64.19±1.62、46.45±2.02、37.90±2.03（圖1A）。由此得知隨著二甲雙胍的作用濃度逐漸增加，TM3細胞的細胞活性也逐漸降低。此外，還在不同時間點（24、48、72 h）研究了二甲雙胍對TM3細胞增殖的作用。發(fā)現(xiàn)隨著藥物作用濃度逐漸增加和藥物作用時間逐漸延長，二甲雙胍對TM3細胞增殖的抑制作用亦逐漸增加，表現(xiàn)為濃度依賴性和時間依賴性（圖1B）。

圖1 MTT檢測結(jié)果Fig.1 MTTassay results

2.2 二甲雙胍對TM3細胞凋亡的影響二甲雙胍可顯著抑制TM3細胞的增殖，細胞增殖的抑制是否通過凋亡途徑發(fā)生？采用流式細胞術(shù)的方法檢測TM3細胞經(jīng)過二甲雙胍處理后的凋亡情況。實驗組給予半抑制濃度6.7 mmol/L的二甲雙胍，48 h后將實驗組與對照組細胞收集并進行Annexin V?FITC/PI染色來標記細胞的凋亡情況。發(fā)現(xiàn)二甲雙胍并未誘導TM3細胞發(fā)生明顯的調(diào)亡（圖2A、B）；二甲雙胍對該細胞的凋亡誘導率為（9.34±0.71）%，與對照組細胞（8.77±0.25）%相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2C）。對此，在蛋白水平上也進行了驗證，眾所周知caspase?3的激活是細胞凋亡的重要標志。將TM3細胞經(jīng)二甲雙胍干預48 h后提取蛋白做Western blot，以乳腺癌細胞MDA?MB?231做陽性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TM3細胞未見表達，而陽性對照乳腺癌細胞有表達（圖2D）。

圖2 二甲雙胍干預后TM3細胞調(diào)亡的結(jié)果Fig.2 Apoptosis of TM3 cells after metformin intervention

2.3 二甲雙胍對TM3細胞周期的影響采用流式細胞術(shù)檢測二甲雙胍對TM3細胞周期的影響。發(fā)現(xiàn)TM3細胞經(jīng)6.7 mmol/L二甲雙胍干預48 h后，實驗組G2/M期細胞所占比例顯著高于對照組（圖3A、B）。同樣TM3細胞實驗組與對照組的G2/M期細胞所占比例亦差異極顯著（圖3C）隨后，通過熒光定量PCR方法檢測了TM3細胞經(jīng)過二甲雙胍干預后調(diào)控細胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的情況。用半抑制濃度6.7 mmol/L的二甲雙胍處理該細胞48 h后，與對照組相比，實驗組cyclin D1和cyclin B1的表達下調(diào)（P＜0.05，圖3D）。

2.4 二甲雙胍激活TM3細胞AMPK信號通路Western blot方法檢測二甲雙胍是否可以激活TM3細胞中的AMPK信號通路從而引起細胞增殖的抑制和周期的阻滯。將TM3細胞用半抑制濃度6.7 mmol/L的二甲雙胍處理，48 h后提蛋白，以α?tubulin作為內(nèi)參蛋白，結(jié)果顯示TM3細胞實驗組的磷酸化的AMPKα（Thr172）與對照組相比略有升高，而未磷酸化的AMPK的表達相應的下降（圖4）。

3 討論

二甲雙胍（1，1--二甲基雙胍鹽酸鹽）作為一種治療糖尿病的有效藥物，可提高胰島素的敏感性并降低空腹胰島素水平［10］。過去幾年里，人們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍還有很多其他作用。例如，有報道稱，二甲雙胍可抑制多種腫瘤細胞的生長和增殖［11-12］，其與卡鉑合用增加卵巢癌的化療效果［13］。也有報道稱，這種藥物會降低糖尿病婦女乳腺癌的發(fā)病率［14］。同時，二甲雙胍已被應用于女性多囊卵巢綜合征的治療，誘導排卵并提高妊娠率［7］。ADARAMOYE等［15］對成年雄性大鼠采用連續(xù)21d灌注二甲雙胍，結(jié)果顯示大鼠睪丸內(nèi)的精子數(shù)量與精子活力明顯下降。此外，還表現(xiàn)為睪丸組織損傷和睪丸功能障礙，并發(fā)睪丸脂質(zhì)過氧化。這表明在二甲雙胍干預下的動物體內(nèi)，成熟精子的生成受到嚴重影響。

圖3 二甲雙胍對TM3細胞周期的影響結(jié)果Fig.3 Effect of metformin on cell cycle of TM3

圖4 Western blot檢測TM3細胞AMPK和p?AMPKα（Thr172）的表達情況Fig.4 Western blot detection of TM3 cells AMPK and p?AMPKα（Thr172）expression

關于二甲雙胍對男性生殖細胞增殖和凋亡的體外實驗，目前僅有FAURE等［16］進行了一項體外細胞實驗，研究二甲雙胍對公雞睪丸支持細胞的影響，他們發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍抑制了公雞睪丸支持細胞的增殖，但并未誘導細胞發(fā)生凋亡，且細胞的形態(tài)亦沒有改變。本研究選擇小鼠睪丸支持細胞作為體外實驗的研究對象，采用不同濃度二甲雙胍分別干預，結(jié)果表明二甲雙胍對TM3細胞的體外增殖有抑制作用，并表現(xiàn)為濃度依賴性和時間依賴性。采用IC50作用濃度的二甲雙胍并沒有誘導TM3細胞發(fā)生明顯的凋亡，由此推測二甲雙胍對小鼠睪丸間質(zhì)細胞增殖的抑制可能是通過其他機制來實現(xiàn)的。細胞周期的順利運行是細胞增殖的關鍵，本研究釆用流式細胞儀檢測二甲雙胍對TM3細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍干預后處于G0/G1期的TM3細胞所占比例顯著減少，而處于G2/M期的細胞比例顯著增多。同時，還進行了實時熒光定量PCR實驗，結(jié)果顯示二甲雙胍干預可下調(diào)該細胞cyclin B1及cyclin D1 mRNA的表達。說明調(diào)控細胞周期關鍵蛋白并使細胞周期阻滯在G2/M期可能是二甲雙胍抑制TM3細胞增殖的重要機制。有研究［17-18］顯示AMPK通路可能調(diào)控睪丸支持細胞的功能。Western blot結(jié)果說明二甲雙胍能夠激活TM3細胞中的AMPK信號通路，通過該通路影響睪丸細胞的生殖和發(fā)育。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)了二甲雙胍具有抑制生殖細胞的體外增殖能力，這種抑制作用可能是通過誘導生殖細胞周期阻滯在G2/M期，并且激活AMPK通路實現(xiàn)的。然而，目前關于二甲雙胍作用于男性生殖系統(tǒng)的確切機制還不完全清楚，有待未來繼續(xù)研究，希望這些實驗數(shù)據(jù)可以為以后研究二甲雙胍與男性生殖提供一些理論依據(jù)和實驗基礎。