金黃色葡萄球菌致急性與慢性輸卵管炎性不孕癥大鼠模型的建立

胡喜姣，林春盛，李碩熙，李 楊，劉 麗*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150001； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154000； 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

不孕癥一直以來是困擾育齡夫婦最大難題，目前亦受到國內(nèi)與國外的高度關(guān)注[1]。近年來，不孕癥特別是輸卵管炎性不孕癥逐年增多[2]，成為生殖醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，國外不孕癥中歸因于輸卵管因素為12%，我國輸卵管性不孕發(fā)病率高達(dá)53.2%[3]。故建立穩(wěn)定可靠的輸卵管炎癥模型，對于防治輸卵管炎性不孕癥及探討藥物治療該病的作用機(jī)制具有重要意義。本課題組已多次成功建立復(fù)合菌致輸卵管炎性不孕癥模型，但在復(fù)合菌的多種菌中，單一菌種造模能力如何，尚未研究。臨床中輸卵管炎多由革蘭氏陽性菌—金黃色葡萄球菌(金葡菌)感染所致[4]，其主要通過產(chǎn)生毒素和侵襲性酶類而致病[5]。本研究利用單一的金葡菌，經(jīng)輸卵管注射感染，成功建立更貼近臨床的急性與慢性輸卵管炎性不孕癥大鼠模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級Wistar大鼠，雌鼠108只，6～8周齡，未孕，體重200～220 g；雄鼠18只，8周齡，體重260～280 g；購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)2015-0001]。在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)[SYXK(黑)2016-004]，福利倫理審查證號：2017031701。

1.2 主要試劑和儀器

金黃色葡萄球菌(菌號FSCC22305，北京東方賽瑞生物技術(shù)有限公司);哥倫比亞培養(yǎng)基(YZB/豫0132-2005)；1%鹽酸二甲基對苯二胺水溶液(4℃，避光保存)；草酸銨結(jié)晶紫染色液、番紅染色液(鄭州蘭森生物技術(shù)有限公司)；營養(yǎng)肉湯粉(杭州天和微生物試劑有限公司)；4%甲醛溶液(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司)。

比濁儀(美國 Becton, Dickinson and Company)；接種環(huán)(江蘇姜堰市康達(dá)實(shí)驗(yàn)器材廠)；二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；電子分析天平(上海方瑞儀器有限公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon)；震蕩儀(上海康禾電光儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(德國 SLEE)；攤烤烘片機(jī)(上海精密儀器儀表有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

金黃色葡萄球菌用生理鹽水稀釋，配成濃度為4×109/mL的致病菌懸液。

1.3.2 動(dòng)物分組及模型的建立

根據(jù)SPSS完全隨機(jī)分組法將雌性大鼠分為正常組、模型組、假手術(shù)組，每組36只。分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境一周后開始實(shí)驗(yàn)。

正常組不給予任何操作。模型組先用10%水合氯醛(0.5 mL/100 g)對每只大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉顯效后，將其俯臥固定，在背部兩側(cè)腎區(qū)下方備皮，消毒鋪巾，取腎區(qū)脊柱兩側(cè)旁約1 cm處行橫切口，打開腹腔，沿子宮找到雙側(cè)輸卵管，無菌濕紗布環(huán)繞子宮近宮角處，在子宮角近輸卵管處進(jìn)針，向輸卵管—卵巢方向緩慢注射4×109/mL金葡菌0.1 mL，注菌前后均用鑷子夾住子宮與進(jìn)針處，防止菌液注入子宮，術(shù)中避免其他組織損傷，逐層縫合關(guān)腹；術(shù)后禁食不禁水8 h。假手術(shù)組操作步驟同模型組，不注菌，向輸卵管—卵巢方向緩慢注射0.9%無菌生理鹽水0.1 mL。

1.3.3 取材

于術(shù)后第7、14、21、28天每組隨機(jī)取材6只。采取脊椎脫臼法處死大鼠后，逐層開腹，肉眼觀察輸卵管形態(tài)及與周圍組織粘連情況，剝離粘連，分離輸卵管，取長約0.2 cm輸卵管進(jìn)行金葡菌培養(yǎng)。剩余輸卵管組織置于4%甲醛溶液中固定待病理檢測。

1.3.4 肉眼觀察

觀察每組輸卵管形態(tài)變化、與周圍組織的粘連情況，是否形成輸卵管屈曲與積水，以及有無腹腔積液等情況。

1.3.5 病理檢測

將輸卵管組織立即投入4%甲醛中，固定，常規(guī)切片，HE 染色，光鏡下觀察病理變化。

1.3.6 金葡菌培養(yǎng)

取長約0.2 cm輸卵管置于載玻片上用刀片反復(fù)切割，無菌棉簽沾營養(yǎng)肉湯反復(fù)按壓切割組織，采用四區(qū)劃線法在哥倫比亞培養(yǎng)基上進(jìn)行金葡菌培養(yǎng)，每區(qū)接種前，接種環(huán)均需高溫滅菌，切割后組織放置于營養(yǎng)肉湯內(nèi)，送至CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

菌落：金葡菌呈金黃色或灰白色，菌落較大光滑濕潤且凸起，周圍可見透明溶血環(huán)；油鏡鏡檢：金葡菌呈紫色或黑紫色葡萄球狀形態(tài)。

1.3.7 受孕率

各組剩余大鼠12只，于造模后第29天以雌雄2∶1的比例合籠7 d，3周后觀察各組受孕情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 觀察結(jié)果

注：(a)正常組；(b)假手術(shù)組；(c)第7天模型組；(d)第14天模型組;(e)第21天模型組;(f)第28天模型組。圖1 輸卵管組織HE染色(Bar=50 μm)Note.(a)Normal group.(b)Sham operated group.(c)The 7th day Model group.(d)The 14th day model group.(e)The 21th day model group.(f)The 28th day model group.Figure.1 HE staining of oviduct tissue

正常組在第7、14、21、28天，輸卵管均呈粉紅色，外觀表面光滑，輸卵管管腔內(nèi)無積水、無積膿，與周圍組織無粘連。假手術(shù)組在造模第7、14、21、28天，輸卵管大體形態(tài)與正常組相比無明顯差異，腹腔各臟器形態(tài)規(guī)整，未見粘連。卵巢、輸卵管以及周圍性腺旁脂肪組織略偏離正常解剖位置。

模型組在造模第7天，輸卵管充血表面欠光滑，管腔明顯增粗，質(zhì)脆，彈性尚可，部分輸卵管出現(xiàn)積水、積膿；盆腔出現(xiàn)膜性粘連、腹膜充血等急性輸卵管炎性改變。腹腔各臟器形態(tài)欠規(guī)整，卵巢、輸卵管以及周圍性腺旁脂肪組織明顯偏離正常解剖學(xué)位置。造模第14天，輸卵管充血表面欠光滑，管腔明顯增粗，體積偏大，質(zhì)脆，彈性尚可，部分輸卵管及卵巢包膜內(nèi)積膿、盆腔粘連，較易分離。腹腔各臟器形態(tài)欠規(guī)整，卵巢、輸卵管以及周圍性腺旁脂肪組織明顯偏離正常解剖學(xué)位置。造模第21天，輸卵管大體形態(tài)與造模第14天相似，盆腔粘連較前稍致密。腹腔各臟器形態(tài)不規(guī)整，卵巢、輸卵管以及周圍性腺旁脂肪組織明顯偏離正常解剖學(xué)位置。造模第28天，輸卵管表面不光滑，管腔粗細(xì)不均，組織發(fā)白，僵硬且易損，彈性差，部分可見輸卵管及卵巢包膜內(nèi)積膿、積水。盆腔粘連嚴(yán)重，難分離；腹腔各臟器形態(tài)變形嚴(yán)重。

2.2 病理結(jié)果

正常組與假手術(shù)組的大鼠輸卵管管壁組織結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整，上皮細(xì)胞排列規(guī)整呈柱狀；黏膜層細(xì)胞連接緊密，有皺褶形態(tài)。(圖1a、1b)

模型組在第7天為輸卵管炎急性期：大鼠輸卵管組織間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)溶解、水樣變。組織間見充血擴(kuò)張血管，部分上皮細(xì)胞纖毛脫落或消失，部分上皮細(xì)胞壞死或崩解, 上皮細(xì)胞變?yōu)榘鶢?，黏膜皺襞僵硬，?xì)胞間質(zhì)內(nèi)見大量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(圖1c)。第14天為輸卵管炎急性后期：大鼠輸卵管組織間血管充血擴(kuò)張，變性壞死細(xì)胞分解、吸收，上皮細(xì)胞呈短柱狀，黏膜皺襞變短淺，細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)可見嗜中性粒細(xì)胞及少許淋巴細(xì)胞浸潤(圖1 d)。第21天為輸卵管炎慢性期：大鼠輸卵管組織間細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)可見淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及少量酸性粒細(xì)胞等慢性炎性細(xì)胞浸潤。上皮細(xì)胞呈卵圓形，上皮細(xì)胞纖毛脫落，黏膜皺襞變淺平，輸卵管組織黏膜層纖維母細(xì)胞增殖(圖1e)。第28天為輸卵管慢性炎典型期：大鼠輸卵管組織細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)可見淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及酸性粒細(xì)胞浸潤；輸卵管組織黏膜層纖維細(xì)胞及纖維母細(xì)胞增殖、增生，以修復(fù)損傷，而致黏膜皺壁變平、減少或消失，甚至管腔狹窄管壁增厚、硬化及粘連(圖1f)。

2.3 金葡菌培養(yǎng)結(jié)果

正常組在造模第7天，培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)1例金葡菌陽性、營養(yǎng)肉湯發(fā)現(xiàn)2例金葡菌陽性；第14天，培養(yǎng)基金葡菌培養(yǎng)均為陰性、營養(yǎng)肉湯發(fā)現(xiàn)1例金葡菌陽性；第21天、第28天，金葡菌培養(yǎng)均為陰性(見表1)。假手術(shù)組在造模第7天，培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)1例金葡菌陽性、營養(yǎng)肉湯發(fā)現(xiàn)3例金葡菌陽性；第14天，培養(yǎng)基金葡菌培養(yǎng)均為陰性、營養(yǎng)肉湯發(fā)現(xiàn)1例金葡菌陽性；第21天、第28天，菌培養(yǎng)均為陰性(見表2)。模型組在造模第7天，培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)5例金葡菌陽性、營養(yǎng)肉湯發(fā)現(xiàn)6例金葡菌陽性；第14天，培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)4例金葡菌陽性、營養(yǎng)肉湯發(fā)現(xiàn)6例金葡菌陽性；第21天，培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)1例金葡菌陽性、營養(yǎng)肉湯發(fā)現(xiàn)2例金葡菌陽性；第28天，金葡菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性(見表3)。

2.4 受孕率情況

與雄性大鼠合籠后，三組均有不同程度受孕發(fā)生。其中正常組受孕率最高，假手術(shù)組次之，但假手術(shù)組與正常組相比差異無顯著性(P> 0.05)，模型組受孕率最低，與正常組和假手術(shù)組相比差異均顯著性(P< 0.05)。(表4)

表1 正常組金葡菌培養(yǎng)情況(n=6)Table.1 Staphylococcus aureus culture in normal group

表2 假手術(shù)組金葡菌培養(yǎng)情況(n=6)Table.2 Staphylococcus aureus culture in sham operation group

表3 模型組金葡菌培養(yǎng)情況(n=6)Table.3 Staphylococcus aureus culture in model group

表4 各組大鼠受孕情況Table.4 Conception of rats in each group

注：與正常組比較，*P< 0.05；與假手術(shù)組比較，#P< 0.05。

Note.Compared with the normal group，*P< 0.05.Compared with the sham operated group，#P< 0.05.

3 討論

自從我國開放二胎政策，迎來生育熱潮，產(chǎn)婦老齡化現(xiàn)象比較普遍，輸卵管是否通暢成為高齡女性生育能力一個(gè)必要評估內(nèi)容[6]。慢性輸卵管炎具有非特異性感染性的病理學(xué)改變，主要表現(xiàn)為炎性反應(yīng)、纖維化和修復(fù)。非特異性感染通過改變微環(huán)境，使輸卵管局部毛細(xì)血管擴(kuò)張，管壁通透性增強(qiáng)，管腔黏膜充血或水腫；隨著血液循環(huán)受阻及炎癥進(jìn)一步發(fā)展，輸卵管管壁淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤，黏膜上皮發(fā)生粘連，黏膜皺襞減少或消失，管腔內(nèi)纖毛擺動(dòng)能力喪失[7]，炎癥繼續(xù)浸潤輸卵管肌層，輸卵管液分泌抗炎性因子引發(fā)纖維化與修復(fù)機(jī)制形成粘連、瘢痕。導(dǎo)致輸卵管炎的病原體可歸納為內(nèi)源性和外源性兩類。內(nèi)源性病原體指存在于陰道內(nèi)寄生的菌群，主要為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、溶血性鏈球菌等。外源性病原體包括沙眼衣原體、支原體、淋病奈瑟菌等。支原體是一類細(xì)胞寄生的，高度多形態(tài)的、細(xì)胞壁缺乏的、在無生命的人工培養(yǎng)基中能生長繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物[8]。淋病奈瑟菌易侵犯生殖道上皮細(xì)胞，且通過與黏膜細(xì)胞特定部位相結(jié)合而破壞黏膜上皮[9]。若發(fā)生淋病奈瑟菌感染后未予及時(shí)治療，較易引起盆腔炎性疾病、生殖道炎等的發(fā)生，最終引發(fā)不孕癥[10]。金葡菌是具有多樣致病因子的革蘭氏陽性菌[11]，是最常見的醫(yī)院獲得性感染病原菌，其致病力強(qiáng)并具有高度耐藥性。且可通過分泌毒素和侵襲性因子等,使細(xì)胞或組織損傷，致感染遷延不愈從而形成慢性感染。故通過金葡萄建立輸卵管急性與慢性炎性不孕癥模型，具有重要意義。

許多學(xué)者運(yùn)用不同動(dòng)物、不同致病菌制作輸卵管炎性不孕癥模型[12]。Corr等[13]運(yùn)用沙眼衣原體經(jīng)陰道感染建立輸卵管炎性不孕癥小鼠模型，謝志波等[14]運(yùn)用自制窺陰器針頭經(jīng)宮頸插入近宮角處注入甲醛，成功制作輸卵管阻塞性不孕模型。王芳軍等[15]研究多模式輸卵管性不孕癥模型制作顯示，輸卵管結(jié)扎術(shù)組阻塞徹底，結(jié)構(gòu)破壞明顯。建立輸卵管炎性不孕癥動(dòng)物模型的方法有很多，將病原微生物注入輸卵管內(nèi)引起其炎性反應(yīng)[16-18]，接近人類輸卵管炎癥感染的途徑。馬寶璋等[19]利用混合菌注入大鼠輸卵管成功建立輸卵管炎性不孕癥模型，該造模方法一直沿用至今[20]。大鼠價(jià)格便宜, 資源豐富, 動(dòng)情期短，較小鼠提供樣本量大，更適合本研究。故課題組選用生物方法，利用臨床常見的金葡菌這一單一菌注入大鼠輸卵管，建立急性與慢性輸卵管炎性不孕癥模型，理論依據(jù)充分，可靠性強(qiáng)。

課題組通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組造模第5天為輸卵管炎急性初期；第7天為輸卵管炎急性典型期;第17天轉(zhuǎn)為慢性炎癥初期；第28天為輸卵管慢性炎典型期。此次研究從肉眼觀察及病理結(jié)果可知，模型組在造模第7天出現(xiàn)急性輸卵管炎典型改變，第28天出現(xiàn)慢性輸卵管炎典型改變，與預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，模型可復(fù)制性高。而陳曉[21]利用濃度為1×109/mL金葡菌接種小鼠陰道造模，在造模第7天，小鼠輸卵管上皮細(xì)胞排列整齊，管腔略增大, 黏膜皺襞漸平，纖毛細(xì)胞頂部纖毛變短、部分脫落, 漿膜層血管充血擴(kuò)張，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤。在造模第14天，輸卵管上皮細(xì)胞呈矮柱狀，管腔擴(kuò)大，黏膜皺襞僵硬、部分變平消失，纖毛大部分脫落，漿膜層血管擴(kuò)張。造模第28天，輸卵管上皮細(xì)胞呈短柱狀，細(xì)胞部分壞死, 管腔明顯擴(kuò)增, 黏膜皺襞基本消失,纖毛細(xì)胞頂部纖毛完全脫落, 漿膜層血管擴(kuò)張。而本研究與其差別在于經(jīng)輸卵管直接接種，并且菌液濃度較之更高，故第7天可發(fā)生急性炎癥典型表現(xiàn)，第28天產(chǎn)生慢性炎癥典型表現(xiàn)從而建立大鼠急性輸卵管炎與慢性輸卵管炎性不孕癥大鼠模型。

有學(xué)者認(rèn)為，慢性輸卵管炎在發(fā)展過程中已無病原體，由有菌性炎癥發(fā)展成無菌性炎癥。金葡菌培養(yǎng)結(jié)果顯示模型組于造模第7、14、21天均培養(yǎng)出金葡菌，隨著細(xì)菌在大鼠體內(nèi)代謝排出，金葡菌培養(yǎng)陽性率呈逐漸降低趨勢，造模第28天培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，與其一致。正常組與假手術(shù)組在造模第7天培養(yǎng)基中金葡菌陽性，且營養(yǎng)肉湯陽性率高于培養(yǎng)基；造模第14、21、28天培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果皆為陰性，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)陽性率呈降低趨勢，說明正常組和假手術(shù)組輸卵管有少量金葡菌，但少量金葡菌不會(huì)致輸卵管產(chǎn)生炎性反應(yīng)。大鼠性周期一般為4～5 d, 妊娠期為19～23 d, 平均為21 d，受孕率結(jié)果顯示，利用金葡菌可成功建立輸卵管炎性不孕癥大鼠模型。

由此可見，采用濃度為4×109/mL金黃色葡萄球菌，注入大鼠輸卵管，可成功建立可靠性強(qiáng)、復(fù)制性高、建模周期短的急性輸卵管炎與慢性輸卵管炎性不孕癥大鼠模型，為急性輸卵管炎及慢性輸卵管炎性不孕癥的防治研究提供可靠動(dòng)物模型。