瑰及乳膏對大鼠III期壓瘡模型纖維結合蛋白及堿性成纖維細胞生長因子的影響

戢艷瓊，郭俐宏，李梓香，陳德森

(1.十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000； 2.湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院，湖北 十堰 442000)

壓瘡是長期臥床或癱瘓患者常見的并發(fā)癥之一，也是臨床最常見的難愈性潰瘍[1]。由于骨隆突部位、骶尾部皮膚和皮下組織缺乏脂肪組織且肌肉層較薄，長時間受壓后會發(fā)生持續(xù)性缺血、缺氧，當體位改變時血流可以再通，局部受壓處組織因反復缺血-再灌注而出現(xiàn)不可逆損傷，最終可導致缺血組織潰爛、壞死而發(fā)生難愈性潰瘍(即壓瘡)，有鑒于此，臨床治療壓瘡時應充分考慮組織缺血-再灌注損傷對壓瘡愈合過程的影響[2-3]。另外，持續(xù)性炎癥反應引起膠原纖維過度降解也是壓瘡形成的重要誘因，故影響炎癥介質IL-1β、IL-6及CRP的合成及釋放均能在一定程度上改變壓瘡病理進程[4-5]。研究表明，F(xiàn)N及BFGF在壓瘡愈合過程中起到重要的作用，增加壓瘡創(chuàng)面FN及BFGF水平有利于間質細胞的增殖和細胞外基質的合成，促進創(chuàng)面肉芽組織新生而加速壓瘡創(chuàng)面組織修復[6]。我院在治療壓瘡時采用自制瑰及乳膏外敷，發(fā)現(xiàn)其對壓瘡臨床療效顯著，本實驗為探討其治療機制，采用缺血-再灌注的方法建立大鼠III期壓瘡模型，在壓瘡部位涂敷瑰及乳膏以研究其治療壓瘡的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性SD大鼠128只，體重(180±10)g，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供[SCXK(鄂)2017-0008]，在湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心屏障實驗室完成實驗[SYXK(鄂)2017-0031]。實驗動物福利批號：湖北醫(yī)藥學院動(福)第2017-64號。自由進食、飲水，取用自然光照，動物房溫度24℃，濕度60%～70%。

1.2 藥品和試劑

瑰及乳膏由十堰市太和醫(yī)院藥劑科提供；FN及BFGF的ELISA試劑盒均購自上海雙贏生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及壓瘡模型的建立

采用隨機數(shù)字表編號，隨機取其中32只編為假手術組，另96只造模，4 d時隨機分為模型組、陽性對照組及玫及乳膏組。

96只大鼠，禁食12 h并禁水4 h后腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，然后剔除大鼠雙側臀毛，消毒(約9 cm2)，切開臀部皮膚(長約2 cm)，切口應深至肌肉，鈍性分離肌肉組織，將消毒磁片(直徑16 mm、厚2 mm)植入到臀部肌肉下，分層縫合肌肉組織、筋膜及皮膚后消毒。術后24 h，在植入磁片的皮膚處放置磁鐵加壓以造成局部組織缺血，2 h后將外源磁鐵取下恢復血流，30 min后再次加壓，反復3個循環(huán)，4 d后以皮膚變黑、變硬及針刺不出血作為判斷III期壓瘡成模標準[7]。本實驗操作簡單，成模率高(100%)。假手術組剔除臀毛消毒后不再做任何處理，所有動物均單籠喂養(yǎng)以防咬傷。

1.3.2 治療給藥

模型組、陽性對照組和瑰及乳膏組清創(chuàng)處理并治療：先用生理鹽水沖洗浸泡創(chuàng)面，再用0.5%碘伏消毒，用無菌剪或手術刀片剪除或切除壞死結痂組織，暴露新鮮肉芽組織，用3%雙氧水沖洗，最后再用0.9%氯化鈉注射液徹底沖洗創(chuàng)面和周圍皮膚，拭干后上藥。陽性對照組外敷水膠體敷料后再覆蓋無菌紗布。瑰及乳膏組將涂有厚度為1 mm的瑰及乳膏紗布覆蓋在壓瘡表面。假手術組及模型組清創(chuàng)處理后外敷生理鹽水紗布。四組均每天換藥一次，連續(xù)治療21 d。

1.3.3 觀察指標

統(tǒng)計各組壓瘡創(chuàng)面顯效時間、壓瘡愈合速度和愈合率。壓瘡愈合速度=創(chuàng)面最終愈合時間/創(chuàng)面的最大直徑。創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。并于治療的第3、7、14、21天時尾靜脈取血檢測血清炎癥介質IL-1β、IL-6及CRP的含量。

1.3.4 固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗

分別于第3、7、14、21天從每組中隨機選取8只動物處死，取壓瘡肉芽組織，采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測BFGF及FN的含量。檢測時將肉芽組織制成勻漿，1000 r/min離心10 min，取上清液作為FN及BFGF的待測樣品。BFGF測定：將BFGF和生物素標記抗體同時溫育，用48孔酶標板加樣，加入稀釋好后的標準品50 μL于反應孔、再加入待測樣品50 μL于反應孔內。然后加入50 μL的生物素標記的抗體。蓋上膜板后輕輕振蕩混勻，37℃溫育1 h。棄孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 min后棄洗滌液，用吸水紙拍干。以上操作重復3次。然后每孔加入80 μL親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min。棄孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，棄洗滌液，用吸水紙拍干。以上操作重復3次。每孔加入底物A、B各50 μL后輕輕振蕩混勻，37℃溫育10 min。避免光照。取出酶標板，迅速加入50 μL終止液后立即測定。在450 nm波長處讀取各孔的OD值、以吸光度OD值為縱坐標，相應的BFGF標準品濃度為橫坐標，取得相應的標準曲線，根據(jù)OD值繪制的標準曲線換算出待測樣品中BFGF的相應濃度(用ng/mL表示)。FN檢測方法同上。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組壓瘡顯效時間、愈合時間、創(chuàng)面愈合率及愈合速度比較

如表1、圖1所示，與假手術組比，模型組顯效時間和愈合時間延長、創(chuàng)面愈合率降低、愈合速度緩慢(P< 0.05)。與模型組比，陽性對照組和瑰及乳膏組顯效時間和愈合時間縮短、創(chuàng)面愈合率和愈合速度提高(P< 0.05)。瑰及乳膏組顯效時間和愈合時間較陽性對照組縮短、創(chuàng)面愈合率和愈合速度較陽性對照組提高(P< 0.05)。

2.2 治療對CRP、IL-1β和IL-6 及組織FN及BFGF含量的影響

如圖2所示，在治療第3、7、14、21天時，與假手術組比，模型組血清CRP、IL-1β和IL-6均升高(P< 0.05)，F(xiàn)N及BFGF降低(P< 0.05)，且在第7、14天時達到高峰，21 d時有回落。與模型組相比較，陽性對照組和瑰及乳膏組在第7、14、21天時，血清CRP、IL-1β和IL-6隨著治療時間延長逐步降低(P< 0.05)，F(xiàn)N及BFGF逐漸升高(P< 0.05)。瑰及乳膏組與陽性對照組同期比，差異有顯著性(P< 0.05)。

表1 各組顯效時間、愈合時間、創(chuàng)面愈合率及壓瘡愈合速度比較Table.1 The effective time, healing time, and wound healing rate of each group were compared with the rate of pressure ulcer healing

注：與模型組比較，aP< 0.05；與陽性對照組比較，bP< 0.05。

Note.Compared with the model group,aP< 0.05.Compared with the positive control group,bP< 0.05.

圖1 各組顯效時間、愈合時間、創(chuàng)面愈合率及壓瘡愈合速度比較Figure.1 The effective time, healing time, and wound healing rate of each group were compared with the rate of pressure ulcer healing

圖2 各組血清CRP、IL-1β和IL-6 及組織FN及BFGF含量比較Figure.2 Comparison of serum CRP, IL-1β, and IL-6, and tissue FN and BFGF levels in each group

3 討論

壓瘡又名壓力性潰瘍，具有難愈合性的特點，壓瘡一旦發(fā)生則經久不愈，III期以上壓瘡常出現(xiàn)嚴重感染，皮膚失去正常功能，進而引起組織的破損及壞死，患者最終因全身器官功能衰竭而死亡，已成為截癱患者的直接死亡原因之一[8-9]。大量動物實驗研究證實，壓瘡的發(fā)生與骨隆突處皮膚和皮下組織長期受壓后復灌造成的皮膚和皮下組織缺血-再灌注損傷有關，且皮膚損傷程度與缺血-再灌注損傷時間呈正相關[10]。FN是一種能維持表皮細胞完整性及防御功能的膠原蛋白，主要由血管上皮細胞和纖維母細胞產生，廣泛存在于細胞表面、基膜、相鄰細胞間及結締組織中，F(xiàn)N與纖維蛋白原及膠原纖維結合后形成的基層膠原纖維-纖維蛋白復合物可促進壓瘡創(chuàng)緣上皮細胞增殖而加速壓瘡潰瘍創(chuàng)面的修復[11]。BFGF由巨噬細胞產生，通過Bcl-2途徑抑制血管內皮細胞的凋亡，調節(jié)和促進血管內皮、神經纖維、上皮細胞及成纖維細胞生長，是一種的重要的促血管生長因子[12-13]。因此，在壓瘡的愈合過程中FN及BFGF均發(fā)揮著重要作用。此外，在壓瘡病理進程中，強炎癥介質IL-1β、IL-6等也發(fā)揮著作用。研究表明，持續(xù)長時間存在的強炎癥介質IL-1β、IL-6可誘導產生大量的破壞創(chuàng)面完整性的酶，這種酶會降解創(chuàng)面細胞基質及纖連蛋白進而導致創(chuàng)面經久不愈[14-15]。

本實驗中使用的瑰及乳膏是我院藥學部自制的外用乳霜，主要配方有中藥當歸、丹參、黃芪、白芨、黃連及輔料霍霍巴油、香精、乳化硅油、甘油、氮酮、十二烷基硫酸鈉、羥苯乙酯、碳酸二辛酯等經過多道工藝配制而成，具有祛腐生肌、生肌斂瘡、養(yǎng)血排毒、消腫排膿等功效，用于治療壓瘡[16]。

在大鼠III期壓瘡皮膚處涂敷瑰及乳膏治療后發(fā)現(xiàn)，瑰及乳膏組顯效時間和愈合時間較陽性對照組縮短，創(chuàng)面愈合率和愈合速度較陽性對照組提高，在治療第14、21、28天時，瑰及乳膏組靜脈血CRP及IL-1β、IL-6均明顯低于模型組和陽性對照組同期水平，F(xiàn)N、BFGF均明顯高于模型組和陽性對照組同期水平。這提示瑰及乳膏不僅能夠有效治療大鼠III期壓瘡，且這種治療作用優(yōu)于陽性對照組所使用的陽性藥物水膠體。分析其可能機制是涂敷瑰及乳膏吸收后，中藥黃連首先發(fā)揮抗菌消炎作用，使強炎癥介質IL-1β、IL-6降低，從而降低炎癥反應產生的破壞性酶對創(chuàng)面細胞基質及纖連蛋白的降解，減輕其對創(chuàng)面完整性的破壞，反應機體炎癥水平的CRP降低有力的佐證了瑰及乳膏這一抗菌消炎作用。而方中黃芪可抑制壓瘡缺血再灌注損傷的炎癥反應并增強其抗氧化損傷能力[17]。丹參可擴張局部血管、改善壓瘡創(chuàng)面微循環(huán)的作用[18]。當歸、白芨等均具有祛腐生肌、生肌斂瘡、消腫排膿、養(yǎng)血排毒之功效[19-20]。吸收后可能起到上調FN及BFGF的作用。BFGF通過調節(jié)和促進血管內皮及成纖維細胞生長，而FN可促進壓瘡創(chuàng)緣上皮細胞增殖，兩者均可促進血管內皮新生及成纖維細胞生長，加速壓瘡局部創(chuàng)面修復和肉芽組織新生[21]。在本實驗中，陽性對照組所用水膠體敷料具有保濕作用，是目前常用的治療創(chuàng)面潰瘍(壓瘡)材料[22]。而瑰及乳膏中的輔料霍霍巴油、香精、乳化硅油、甘油、氮酮、十二烷基硫酸鈉、羥苯乙酯、碳酸二辛酯等也具有保濕作用，可使壞死組織軟化、溶解，還可吸收創(chuàng)面滲出物、促進肉芽組織生長的作用，且這種作用優(yōu)于水膠體敷料，更加符合壓瘡“濕性愈合”的理論。

綜上所述，瑰及乳膏可能通過抑制強炎癥介質IL-6、IL-1β引起的炎癥反應產生的破壞性酶對創(chuàng)面細胞基質及纖連蛋白的降解，改善壓瘡創(chuàng)面微循環(huán)、增加FN及BFGF等促表皮生長因子的合成來促進間質細胞的增殖和細胞外基質的合成，促進壓瘡肉芽組織生長、加速組織修復、提高壓瘡愈合速度和愈合率、縮短治療時間，降低壓瘡惡化風險的發(fā)生。