楊 洋,陶 濤,付 潔,何曉英,李小剛
(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內科,四川瀘州 646000)
缺血性卒中是成人致殘最主要的原因,大多數(shù)腦梗死患者殘留嚴重而持久的神經(jīng)功能缺損。腦梗死后神經(jīng)再生和神經(jīng)可塑性是當今神經(jīng)科學研究的熱點。目前認為受損神經(jīng)元的軸突再生和突觸形成與神經(jīng)功能恢復密切相關,中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元信息網(wǎng)絡整合功能的重建,形成新的神經(jīng)環(huán)路,可促進神經(jīng)功能的恢復。米諾環(huán)素是一種第二代半合成的四環(huán)素類抗生素,被認為是目前最有前途的神經(jīng)保護劑。動物研究表明,米諾環(huán)素可促進大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元軸突再生[1],近期一項臨床研究顯示,急性缺血性卒中患者早期使用米諾環(huán)素可促進患者神經(jīng)功能的恢復[2]。本課題組前期的體外研究表明,米諾環(huán)素對PC12細胞氧糖剝奪損傷具有保護作用,可以顯著提高細胞的存活率且促進神經(jīng)突的生長[3],但其具體機制尚不明確。肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)是Rho激酶(ROCK)的下游底物之一,活化的ROCK滅活MLCP,使其不能水解MLC的磷酸基團,從而提高細胞內MLC的磷酸化水平,導致生長錐的崩解及軸突回縮[4]。所以本研究旨在觀察米諾環(huán)素對氧糖剝奪/復氧后PC12細胞神經(jīng)突生長的影響,并探討MLCP/MLC信號通路對神經(jīng)突生長的調節(jié)作用。
1.1材料與試劑 PC12細胞高分化細胞株(中科院上海細胞庫),DMEM無糖培養(yǎng)基(Gibco公司),鹽酸米諾環(huán)素(美國Sigma公司),MLCP抑制劑Calyculin A、兔抗MLC和兔抗p-MLC(美國CST公司),兔抗MAP-2及小鼠抗GAPDH(美國Santa Cruz公司),Dylight標記山羊抗兔抗體(碧云天生物公司)。其他試劑均購于相應代理商。
1.2PC12細胞的傳代培養(yǎng) 體外培養(yǎng)PC12細胞,每3天換液1次,待細胞長滿80%~90%時,用0.25%胰酶消化后,以1∶3進行傳代培養(yǎng),取第7~9代細胞進行實驗。取生長狀態(tài)良好的細胞,用DMEM培養(yǎng)液吹打成細胞懸液,計數(shù)后分別以5×104/孔的細胞密度接種在96孔板,4×105/孔接種在24孔板,2×106/孔接種在75 cm2的培養(yǎng)瓶,置于37 ℃ 5% CO2恒溫孵箱內培養(yǎng)。
1.3氧糖剝奪/復氧模型的建立 參照本課題組前期報道的方法[5],先去掉培養(yǎng)液,PBS清洗3次后,加入不含血清的DMEM無糖培養(yǎng)基,置于含94% N2,1% O2和5% CO2的孵箱中培養(yǎng),6 h后更換成DMEM高糖培養(yǎng)基,置于含5% CO2的正常氧孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。
1.4實驗分組 將PC12細胞隨機分為正常組、模型組、米諾環(huán)素組(MC組)和MLCP抑制劑組(Cal組)。正常組不進行任何處理;模型組采取氧糖剝奪6 h再復氧24 h;米諾環(huán)素組在氧糖剝奪及復氧全過程中加入1 μmol/L米諾環(huán)素;MLCP抑制劑組在氧糖剝奪1 h前預先加入1 nmol/L MLCP抑制劑,余同米諾環(huán)素組。
1.5CCK-8法檢測細胞活性 參照CCK-8試劑盒說明書,復氧24 h后,每組每孔均加入10 μL的CCK-8試劑,放入37 ℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,選擇490 nm波長,然后在酶標儀上檢測96孔板中各孔的吸光度值[OD490],每組6個復孔,重復3次實驗,按公式計算PC12細胞的存活率=[實驗組平均OD490/正常組平均OD490]×100%。
1.6免疫細胞熒光 復氧24 h后,從24孔板中取出長有細胞的蓋玻片,PBS洗滌3次后,室溫下用4%多聚甲醛固定20 min,PBS漂洗3次后滴加0.3% Triton X-100 37 ℃下破膜20 min,PBS漂洗后加10%山羊血清置于37 ℃恒溫箱封閉45 min,去除血清后加入兔抗MAP2抗體(1∶100)于4 ℃恒溫箱孵育過夜,對照組用PBS代替一抗,PBS漂洗后加入Dylight 594標記山羊抗兔抗體(1∶150)37 ℃避光孵育1 h,PBS漂洗后加入4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染5 min,50%甘油封片,熒光顯微鏡下觀察并拍照,在200倍熒光顯微鏡下隨機選取10個視野,實驗重復3次,采用Image-Proplus軟件對熒光圖像進行分析,計算PC12細胞神經(jīng)突的平均長度。
1.7Western blot 參照凱基全蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白并測定樣品蛋白濃度,以1∶4加入5×上樣緩沖液,煮沸變性5 min。每孔加入100 μg蛋白樣品進行電泳分離(12% SDS-PAGE,60 V、45 min,80 V、90 min)后轉膜(PDVF膜,250 mA、40 min),分別加入一抗MLC(1∶1 000),p-MLC(1∶500)和GAPDH(1∶1 000),4 ℃孵育過夜,次日加入二抗(1∶3 000)孵育后ECL顯影并拍照,用Quantity One軟件對條帶進行分析,以目的與內參條帶光密度的比值作為蛋白表達的相對含量。
2.1米諾環(huán)素對OGD/R損傷的PC12細胞的保護作用 復氧24 h后,模型組PC12細胞的存活率為(48.6±3.2)%,米諾環(huán)素(1 μmol/L)處理后能夠明顯提高氧糖剝奪/復氧后PC12細胞的存活率[(77.7±3.3)%,P<0.05,圖1],而米諾環(huán)素對正常培養(yǎng)PC12細胞的存活率無影響(P>0.05)。
2.2米諾環(huán)素對GAP-43蛋白表達的影響 在正常組PC12細胞中加入米諾環(huán)素后GAP-43蛋白無明顯改變,米諾環(huán)素并不會促進正常PC12細胞GAP-43的表達,也對正常PC12細胞無毒性作用;MC組GAP-43蛋白的表達(1.69±0.22)較模型組明顯升高(P<0.05);而Gal組GAP-43蛋白的表達明顯低于MC組(0.32±0.13vs.1.69±0.22,P<0.05),見圖2。
#:P<0.05,與正常組比較;★:P<0.05,與模型組比較
圖1米諾環(huán)素對PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷后的保護作用
1:正常組;2:模型組;3:MC組;4:Cal組;5:正常+MC組
圖2米諾環(huán)素對氧糖剝奪/復氧損傷后PC12細胞GAP-43蛋白表達的影響
2.3米諾環(huán)素促進PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷后神經(jīng)突生長 熒光顯微鏡下觀察可見正常組PC12細胞呈梭形,細胞兩極各有一個長突起(圖3)。模型組神經(jīng)突平均長度為(15.75±5.92)μm,MC組為(44.79±5.36)μm,Cal組為(25.33±5.39)μm,各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
A:正常組;B:模型組;C:MC組;D:Cal組
圖3米諾環(huán)素對氧糖剝奪/復氧損傷后PC12細胞神經(jīng)突生長的影響(×200)
2.4米諾環(huán)素對PC12細胞OGD/R損傷后MLC磷酸化的影響 正常組PC12細胞中p-MLC蛋白僅有少量表達(0.21±0.06);模型組p-MLC的表達顯著增加(1.02±0.12),經(jīng)米諾環(huán)素處理后,PC12細胞p-MLC的表達較模型組明顯下降(0.33±0.07),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);預先加入抑制劑Calyculin A的PC12細胞, p-MLC的表達較MC組明顯增加(1.38±0.09,P<0.05)。各組間MLC蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖4。
1:正常組;2:模型組;3:MC組;4:Cal組
圖4米諾環(huán)素對氧糖剝奪/復氧損傷后PC12細胞MLC磷酸化的影響
缺血缺氧性腦損傷可造成不同程度的神經(jīng)功能缺損,而神經(jīng)功能的恢復與神經(jīng)元的修復及軸突再生密切相關,促進軸突再生、神經(jīng)元網(wǎng)絡重建以及突觸環(huán)路的形成是目前研究的熱點,也成為神經(jīng)康復的首要目標。PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷真實地反映了缺血性腦卒中引起的腦損害。
米諾環(huán)素是一種高脂溶性的四環(huán)素類抗生素,它具有抗菌和抗炎活性并被臨床實踐證實為一種治療粉刺和關節(jié)炎的有效藥物。米諾環(huán)素能有效的通過血腦屏障從而在顱腦創(chuàng)傷、卒中、脊髓損傷、神經(jīng)退行性疾病如肌萎縮性側索硬化、帕金森病、亨廷頓病及多發(fā)性硬化等疾病的動物模型中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[6-7]。近年來多項體外研究表明米諾環(huán)素對PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷具有一定的保護作用[8-9],本研究前期的研究結果顯示,100 nmol/L至10 μmol/L米諾環(huán)素能提高氧糖剝奪/復氧損傷后PC12細胞的存活率,其中1 μmol/L米諾環(huán)素對PC12細胞的保護作用最佳。因此本試驗選取該濃度的米諾環(huán)素用于后續(xù)神經(jīng)突生長的研究。
RhoA/ROCK信號途徑是調節(jié)神經(jīng)元軸突再生的主要信號通路,其下游底物之一肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)是重要的細胞骨架蛋白之一,相對分子質量為20×103,其表達與突觸再生密切相關。細胞內的MLC磷酸化水平對調節(jié)突出再生起到重要作用,在肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)雙重調節(jié)下,MLC發(fā)生磷酸化和去磷酸化的相互轉化。既往研究證實,Calyculin A可通過抑制MLCP阻斷神經(jīng)生長因子(NGF)對PC12細胞神經(jīng)突生長的促進作用[10]。生長相關蛋白-43(GAP-43)是一種表達在軸突末梢的突出前蛋白,與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸形成和神經(jīng)再生有著密切關系,已經(jīng)被證實在神經(jīng)細胞受損之后的軸突再生過程中表達明顯增高,且在促進神經(jīng)突生長和突出重塑中起到至關重要的作用[11-12],可通過觀察其表達水平,了解軸突再生情況。
本研究發(fā)現(xiàn),氧糖剝奪/復氧可誘導PC12細胞凋亡,降低其存活率,并通過上調p-MLC,誘導神經(jīng)突回縮或抑制軸突再生。復氧24 h后,MC組較模型組PC12細胞存活率明顯增高,說明米諾環(huán)素可緩解PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷。模型組較正常組p-MLC水平明顯增高,而MC組較模型組p-MLC有明顯下降趨勢,且細胞存活率、GAP-43的表達及軸突長度測定較模型組均有明顯增高,說明米諾環(huán)素可能通過調節(jié)MLCP/MLC信號通路,調節(jié)細胞內MLC的磷酸化水平,進而緩解氧糖剝奪/復氧對PC12細胞的損傷作用并促進軸突再生。模型組較MC組p-MLC表達明顯增高,GAP-43表達明顯減少,且神經(jīng)突長度明顯縮短,說明Calyculin A可能阻斷了米諾環(huán)素與MLCP/MLC信號通路的相互作用。因此,筆者認為MLCP/MLC信號通路可能與米諾環(huán)素促進PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷后神經(jīng)軸突再生密切相關。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)1 μmol/L米諾環(huán)素對PC12細胞氧糖剝奪/復氧損傷具有保護作用,可明顯提高損傷細胞的存活率,顯著促進缺血缺氧/復氧之后神經(jīng)突的生長,其機制可能為米諾環(huán)素促進受損的PC12細胞中MLCP/MLC信號通路激活,使得 MLC磷酸化水平降低,同時促進GAP-43表達增加,進而促進軸突再生及突觸網(wǎng)絡的重建。本研究發(fā)現(xiàn),米諾環(huán)素對氧糖剝奪/復氧損傷的PC12細胞神經(jīng)突生長的促進作用與MLCP/MLC信號通路的激活密切相關,揭示了米諾環(huán)素促進PC12細胞神經(jīng)突生長潛在的細胞和分子機制,為將來的臨床應用提供了理論基礎。未來的研究可進一步探索MLCP/MLC信號通路激活靶點,為新型藥物的研究提供理論依據(jù)。