運動結(jié)合甲魚油對老年肥胖大鼠chemerin的影響*

宋威巍， 柏友萍△， 蘇 敏， 王 明， 沈瑞睿， 杜康健， 夏行權(quán)， 聶劉旺

(1. 安徽師范大學(xué)體育學(xué)院， 蕪湖 241003； 2. 安徽省生物資源保護和利用重點實驗室， 安徽師范大學(xué)， 蕪湖 241000)

隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活的提高，我國超重及肥胖人群的比例在逐年增加，老年人超重與肥胖人群也在逐年不斷增加。2010年，我國成年人超重比例為32.1%，肥胖率為9.9%[1]。肥胖不利于健康，易增加老年人各種疾病發(fā)病率，如胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓及相關(guān)炎癥。新近研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細胞因子chemerin參與調(diào)節(jié)脂肪細胞分化、肥胖和胰島素抵抗等生理過程[2-3]。

運動既可減肥，又能促進身體健康。因此，運動對chemerin、血糖水平及胰島素敏感性的影響受到廣泛關(guān)注[4]。目前，尚不清楚甲魚油、運動結(jié)合甲魚油對chemerin mRNA和蛋白表達、血糖水平、胰島素敏感性的影響。本實驗建立老年肥胖SD大鼠實驗動物模型，采用qRT-PCR、Western blot和ELISA技術(shù)，探討甲魚油、運動結(jié)合甲魚油對老年肥胖大鼠chemerin和胰島素敏感性及血糖水平的影響，為防治老年肥胖引起的2型糖尿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立與分組

雄性SD大鼠50只，鼠齡3周，測定體重(74.46±7.43)g和體長(12.37±0.52)cm，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d。根據(jù)體重無差異性(P>0.05)原則，將SD雄性大鼠隨機分為對照組(n=12)和實驗組(n=32)，所有大鼠均自由飲食、飲水。對照組大鼠喂食脂肪含量比為6.0%的普通飼料。實驗組大鼠喂食高脂飼料，生長發(fā)育期大鼠喂食的高脂飼料的脂肪含量比為36.3%，壯年期和老年期大鼠喂食的高脂飼料的脂肪含量比為40.0%。建模期間，室溫18℃～22℃，相對濕度50%～70%，每天光照12 h，每天定時觀察飲水量、飲食量和排泄量，每周測量一次體長和體重并詳細記錄。

老年肥胖SD大鼠建模成功的依據(jù)為：鼠齡為60周，肥胖組大鼠體重大于對照組體重的120%[5]。對照組大鼠平均體重為(758.73±45.57)g，建模成功標準的老年肥胖大鼠體重為910.48 g，實驗組大鼠平均體重為(929.56±81.54)g。在建模成功的老年大鼠中，選取24只并隨機分為4組：肥胖對照組(obese control group，OC)、甲魚油組(turtle oil group，TO)、運動組(exercise group，OE)、運動結(jié)合甲魚油組(obese supplement of turtle oil combined with exercise group，OET)，從自然生長大鼠中隨機選取6只為對照組(control group，C)。

1.2 儀器與試劑

儀器：酶標儀(Tecan Sunrise/瑞士)，洗板機(Tecan Columbus Washer/瑞士)；電子秤(JM-A20001/中國)稱體重；全自動生化分析儀(日立7060)；6跑道大鼠跑臺(Wi32812/北京)；PCR儀(MJ research，PTC200)，臺式高速離心機(eppendorf，Centrifuge5417)，高速冷凍離心機(力康生科，Neofuge15R)，實時熒光定量PCR儀(博日，line-gene K FQD-48A)；凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達科技，JD801)，可見紫外分光光度計(日立，U-2001)。

試劑：測定chemerin mRNA的主要試劑：Trizol(SunShineBio/SN114)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega/M1705)。測定chemerin 蛋白表達的主要試劑：6×SDS protein loading buffer(還原型)(Sunshinebio/SN336)，電泳液緩沖液(25 mmol/L Tris，0.25 mol/L甘氨酸，0.1%SDS，Sunshinebio/SN343)，兔抗chemerin抗體(Bioss/bs-1501R)，羊抗兔IgG-HRP(H+L)(Sunshinebio/SN134)，小鼠抗β-actin抗體(Boster/BM0627)，羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(Sunshinebio/SN135)，PageRuler Prestained Protein ladder(Fermentas/SM0671)。chemerin血漿濃度試劑盒(美國TSZ公司)；血糖試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司)。

1.3 運動及甲魚油方案的設(shè)計與實施

本運動方案的設(shè)計以本實驗室前期研究為依據(jù)進行相關(guān)改進[6]。運動干預(yù)前，對運動組大鼠進行為期5 d的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練，最后根據(jù)老年肥胖大鼠的運動能力設(shè)定的運動強度為：大鼠跑臺坡度0°，速度15 m/min，每組運動15 min，4組/次，組間休息5 min，總運動時間60 min，1次/日，每周5次(周二和周五休息)，持續(xù)8周。對照組不施加運動和甲魚油干預(yù)，安靜狀態(tài)下籠養(yǎng)。

本實驗使用的甲魚油是委托安徽省生物資源保護和利用重點實驗室聶劉旺教授提供，系采用新鮮的甲魚為材料，以國內(nèi)實驗室公認的索氏提取法，利用脂溶性溶劑提取的甲魚油，其純度為99.9%，主要成分為油酸、α-亞麻酸及花生四烯酸等。補充甲魚油為運動后1 h灌胃，劑量以本實驗室前期共軛亞油酸SD大鼠灌胃的研究為依據(jù)[7]，本次老年肥胖大鼠補充甲魚油0.3～0.4 ml/次(人體推薦量4.8 g/60 kg體重的4倍)[8]，OET組為大鼠運動后休息1 h后灌胃，對照組大鼠采用等體積生理鹽水灌胃，5次/周，持續(xù)8周。

1.4 樣本采集與保存

大鼠8周干預(yù)后禁食12 h、禁水6 h。大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛溶液(1.22 mg/kg體重)麻醉，剖腹取大鼠腹主動脈血，立即分離血漿，測定血漿chemerin濃度、血糖及胰島素水平。血糖水平采用全自動生化儀測定。內(nèi)臟脂肪組織為大鼠腎周和附睪的脂肪組織，用濾紙吸干表面組織液，取部分脂肪組織立即置于Trizol中，按照說明書提取總RNA；另取部分脂肪組織包在錫箔紙中，置-80℃冰箱保存，分別測chemerin mRNA和蛋白質(zhì)表達。

1.5 qRT-PCR檢測內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA表達

chemerin的引物：Forward：5'-ATCAAACCAAATGGGAGGAAGC-3'； Reverse：5'-GGGAAGAAGTAGATGCGGGAGTC-3'； β-actin的引物: Forward：5'-CTAGAGGGTGTCCGCAATG-3'； Reverse：5'-CAGTGGGAAGGTGTAGTCAGTC-3'。

以Trizol法提取內(nèi)臟脂肪組織細胞總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使全長mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，短暫離心，通過預(yù)變性、變性、退火及延伸進行PCR擴增。融解曲線分析：60 ℃～95 ℃環(huán)境下，溫度每次升高0.3℃，時間間隔為5 s，chemerin的Tm值為83℃。根據(jù)上述實驗得出的數(shù)據(jù)，軟件自動計算出閾值與Ct值，△Ct= Ct(目的基因)- Ct(β-actin)，相對定量采用2-△Ct法。chemerin mRNA基因表達量結(jié)果采用2-△Ct×1000。

1.6 Western blot法檢測內(nèi)臟脂肪組織chemerin蛋白表達

用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜放置于封閉液中，滴加一抗(兔抗chemerin抗體)后37℃孵育3 h，室溫下于脫色搖床上用TBST洗4次，10 min/次；然后加入TBS液中，滴加二抗37℃孵育1 h，室溫下于脫色搖床上用TBST洗5次，10 min/次。進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在顯影液中沖洗膠片，之后放入定影液中漂洗10 s；用水沖洗后室溫靜置晾干。掃描膠片，測定目的條帶的凈吸光度值。

1.7 ELISA檢測血漿chemerin濃度和胰島素濃度

采用ELISA(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)的雙抗體夾心法，測定大鼠血漿標本中chemerin和胰島素濃度。在Excel工作表中，橫坐標為標準品濃度，縱坐標為相對應(yīng)的A值，得出標準品線性回歸曲線。chemerin濃度值：曲線方程為y=0.039x-0.026，標準品試劑測量值與實際測量值相關(guān)系數(shù)r=0.999。胰島素濃度值：曲線方程為y=0.020x+0.008，標準品試劑測量值與實際測量值相關(guān)系數(shù)r=0.999。把該方程代入Excel工作表中，得到相應(yīng)的濃度值，再乘以5為樣本實際濃度。以胰島素敏感性指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)反映胰島素敏感性，ISI計算公式：ISI=1/[log(I0)+log(G0)]，I0代表空腹胰島素含量(μU/ml)，G0代表空腹血糖濃度(mmol/L)[9]。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA和蛋白質(zhì)表達的變化

chemerin mRNA表達：OC組呈現(xiàn)高于C組的趨勢(P>0.05)，OE、TO組與OC組無統(tǒng)計學(xué)差異，OET組呈低于OC、OE、TO組的趨勢(P>0.05，表1)。chemerin 蛋白質(zhì)表達：OC組與C組無明顯差異(P>0.05)；OE、TO組均低于OC組(P<0.05)；OET組明顯低于OC、OE、TO組(P<0.01，表1，圖1)。

GroupnChemerin mRNAChemerin proteinC51.612±0.2570.911±0.020OC51.767±0.1121.057±0.075**OE61.744±0.2550.857±0.080**#TO51.763±0.2870.870±0.074**#OET61.518±0.2720.586±0.013

C： Control group； OC： Obese control group； OE： Obese exercise group； TO： Turtle oil group； OET： Obese supplement of turtle oil combined with exercise group

**P<0.01vsOET group；#P<0.05vsOC group

2.2 老年肥胖大鼠血漿chemerin 濃度、血糖水平及ISI的變化

血漿chemerin濃度：OC組明顯高于C組(P<0.01)；TO、OE、OET組均明顯低于OC組(P<0.05，P<0.01)。血糖水平：OC組高于C組(P<0.01)；TO、OE、OET組均低于OC組(P<0.05)。ISI：OC組低于C組(P<0.05)；OE、TO、OET組均明顯高于OC組(P<0.01，表2)。

Fig.1Comparision of chemerin protein expression of rats among groups

GroupnChemerin concentration(μg/L)Blood sugar(mmol/L)ISIC516.692±1.54511.636±3.5680.395±0.019OC519.051±0.927**17.930±6.094**0.369±0.017*OE616.261±0.981##12.842±1.905#0.396±0.015##TO517.308±1.022#12.550±2.669#0.397±0.016##OET616.389±0.609##12.933±1.203#0.399±0.008##

C： Control group； OC： Obese control group； OE： Obese exercise group； TO： Turtle oil group； OET： Obese supplement of turtle oil combined with exercise group

*P<0.05,**P<0.01vsC group；#P<0.05,##P<0.01vsOC group

3 討論

chemerin是近年來研究肥胖相關(guān)代謝疾病的熱點之一。研究指出[10]，高脂膳食飼養(yǎng)大鼠的內(nèi)臟脂肪組織中chemerin mRNA表達明顯高于正常大鼠。肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織中chemerin蛋白質(zhì)表達、血漿chemerin水平均高于自然生長大鼠[11]。運動能夠減少肥胖鼠和瘦鼠的脂肪量、減低肥胖基因(ob)mRNA水平，運動增加能量消耗，使ob基因?qū)δ芰肯脑黾拥姆磻?yīng)性表達降低，使體重維持在一個相對穩(wěn)定的水平[12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，有氧運動干預(yù)后，高脂膳食大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA表達和蛋白質(zhì)表達顯著降低[13]。甲魚油作為一種食用油脂，富含多種不飽和脂肪酸，尤其是二十二碳六烯酸(decosahexaenoic acid, DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)能夠調(diào)節(jié)血脂、抗高血壓、維持糖代謝的穩(wěn)定，可以改善大鼠肝臟中相關(guān)基因mRNA表達量[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA和蛋白質(zhì)表達呈現(xiàn)高于正常老年大鼠的趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于大鼠樣本數(shù)偏少、飼養(yǎng)方式和飼養(yǎng)環(huán)境等條件所導(dǎo)致，未來將進一步深入研究。運動與甲魚油干預(yù)后，chemerin蛋白質(zhì)表達明顯低于單純運動干預(yù)和單純甲魚油干預(yù)，提示運動結(jié)合甲魚油的干預(yù)效果更明顯，二者有明顯的協(xié)同性。

肥胖患者有糖、脂代謝異常，血糖水平高于正常人，且維持血糖平衡的能力降低，血糖下降速度變慢，胰島素分泌增多[16]。有規(guī)律的運動和低脂膳食干預(yù)能有效促進機體糖的利用和轉(zhuǎn)化，降低血糖和血脂水平，顯著提高其ISI，改善內(nèi)分泌和新陳代謝[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年肥胖大鼠血漿chemerin濃度和血糖水平明顯升高，ISI降低。通過運動和/或甲魚油的干預(yù)，血漿chemerin濃度和血糖水平明顯下降，ISI改善；但運動和甲魚油的干預(yù)無協(xié)同性。說明運動和/或甲魚油干預(yù)能夠明顯改善老年肥胖大鼠血漿chemerin水平，是否通過血漿chemerin水平的降低來改善ISI，進而降低血糖水平尚需進一步研究。

綜上所述，老年肥胖大鼠血漿chemerin濃度及血糖水平增高，胰島素敏感性降低；運動結(jié)合甲魚油能明顯降低老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin蛋白質(zhì)表達，降低血漿chemerin濃度及血糖水平，提高胰島素敏感性。推測運動結(jié)合甲魚油干預(yù)可能是改善老年肥胖和預(yù)防肥胖相關(guān)疾病的有效手段。