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    運動結(jié)合甲魚油對老年肥胖大鼠chemerin的影響*

    2018-08-29 03:26:02宋威巍柏友萍沈瑞睿杜康健夏行權(quán)聶劉旺
    關(guān)鍵詞:血漿胰島素血糖

    宋威巍, 柏友萍△, 蘇 敏, 王 明, 沈瑞睿, 杜康健, 夏行權(quán), 聶劉旺

    (1. 安徽師范大學(xué)體育學(xué)院, 蕪湖 241003; 2. 安徽省生物資源保護(hù)和利用重點實驗室, 安徽師范大學(xué), 蕪湖 241000)

    隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活的提高,我國超重及肥胖人群的比例在逐年增加,老年人超重與肥胖人群也在逐年不斷增加。2010年,我國成年人超重比例為32.1%,肥胖率為9.9%[1]。肥胖不利于健康,易增加老年人各種疾病發(fā)病率,如胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓及相關(guān)炎癥。新近研究發(fā)現(xiàn),脂肪細(xì)胞因子chemerin參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化、肥胖和胰島素抵抗等生理過程[2-3]。

    運動既可減肥,又能促進(jìn)身體健康。因此,運動對chemerin、血糖水平及胰島素敏感性的影響受到廣泛關(guān)注[4]。目前,尚不清楚甲魚油、運動結(jié)合甲魚油對chemerin mRNA和蛋白表達(dá)、血糖水平、胰島素敏感性的影響。本實驗建立老年肥胖SD大鼠實驗動物模型,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA技術(shù),探討甲魚油、運動結(jié)合甲魚油對老年肥胖大鼠chemerin和胰島素敏感性及血糖水平的影響,為防治老年肥胖引起的2型糖尿病提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動物模型建立與分組

    雄性SD大鼠50只,鼠齡3周,測定體重(74.46±7.43)g和體長(12.37±0.52)cm,先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d。根據(jù)體重?zé)o差異性(P>0.05)原則,將SD雄性大鼠隨機(jī)分為對照組(n=12)和實驗組(n=32),所有大鼠均自由飲食、飲水。對照組大鼠喂食脂肪含量比為6.0%的普通飼料。實驗組大鼠喂食高脂飼料,生長發(fā)育期大鼠喂食的高脂飼料的脂肪含量比為36.3%,壯年期和老年期大鼠喂食的高脂飼料的脂肪含量比為40.0%。建模期間,室溫18℃~22℃,相對濕度50%~70%,每天光照12 h,每天定時觀察飲水量、飲食量和排泄量,每周測量一次體長和體重并詳細(xì)記錄。

    老年肥胖SD大鼠建模成功的依據(jù)為:鼠齡為60周,肥胖組大鼠體重大于對照組體重的120%[5]。對照組大鼠平均體重為(758.73±45.57)g,建模成功標(biāo)準(zhǔn)的老年肥胖大鼠體重為910.48 g,實驗組大鼠平均體重為(929.56±81.54)g。在建模成功的老年大鼠中,選取24只并隨機(jī)分為4組:肥胖對照組(obese control group,OC)、甲魚油組(turtle oil group,TO)、運動組(exercise group,OE)、運動結(jié)合甲魚油組(obese supplement of turtle oil combined with exercise group,OET),從自然生長大鼠中隨機(jī)選取6只為對照組(control group,C)。

    1.2 儀器與試劑

    儀器:酶標(biāo)儀(Tecan Sunrise/瑞士),洗板機(jī)(Tecan Columbus Washer/瑞士);電子秤(JM-A20001/中國)稱體重;全自動生化分析儀(日立7060);6跑道大鼠跑臺(Wi32812/北京);PCR儀(MJ research,PTC200),臺式高速離心機(jī)(eppendorf,Centrifuge5417),高速冷凍離心機(jī)(力康生科,Neofuge15R),實時熒光定量PCR儀(博日,line-gene K FQD-48A);凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技,JD801),可見紫外分光光度計(日立,U-2001)。

    試劑:測定chemerin mRNA的主要試劑:Trizol(SunShineBio/SN114),M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega/M1705)。測定chemerin 蛋白表達(dá)的主要試劑:6×SDS protein loading buffer(還原型)(Sunshinebio/SN336),電泳液緩沖液(25 mmol/L Tris,0.25 mol/L甘氨酸,0.1%SDS,Sunshinebio/SN343),兔抗chemerin抗體(Bioss/bs-1501R),羊抗兔IgG-HRP(H+L)(Sunshinebio/SN134),小鼠抗β-actin抗體(Boster/BM0627),羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(Sunshinebio/SN135),PageRuler Prestained Protein ladder(Fermentas/SM0671)。chemerin血漿濃度試劑盒(美國TSZ公司);血糖試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司)。

    1.3 運動及甲魚油方案的設(shè)計與實施

    本運動方案的設(shè)計以本實驗室前期研究為依據(jù)進(jìn)行相關(guān)改進(jìn)[6]。運動干預(yù)前,對運動組大鼠進(jìn)行為期5 d的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練,最后根據(jù)老年肥胖大鼠的運動能力設(shè)定的運動強(qiáng)度為:大鼠跑臺坡度0°,速度15 m/min,每組運動15 min,4組/次,組間休息5 min,總運動時間60 min,1次/日,每周5次(周二和周五休息),持續(xù)8周。對照組不施加運動和甲魚油干預(yù),安靜狀態(tài)下籠養(yǎng)。

    本實驗使用的甲魚油是委托安徽省生物資源保護(hù)和利用重點實驗室聶劉旺教授提供,系采用新鮮的甲魚為材料,以國內(nèi)實驗室公認(rèn)的索氏提取法,利用脂溶性溶劑提取的甲魚油,其純度為99.9%,主要成分為油酸、α-亞麻酸及花生四烯酸等。補(bǔ)充甲魚油為運動后1 h灌胃,劑量以本實驗室前期共軛亞油酸SD大鼠灌胃的研究為依據(jù)[7],本次老年肥胖大鼠補(bǔ)充甲魚油0.3~0.4 ml/次(人體推薦量4.8 g/60 kg體重的4倍)[8],OET組為大鼠運動后休息1 h后灌胃,對照組大鼠采用等體積生理鹽水灌胃,5次/周,持續(xù)8周。

    1.4 樣本采集與保存

    大鼠8周干預(yù)后禁食12 h、禁水6 h。大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛溶液(1.22 mg/kg體重)麻醉,剖腹取大鼠腹主動脈血,立即分離血漿,測定血漿chemerin濃度、血糖及胰島素水平。血糖水平采用全自動生化儀測定。內(nèi)臟脂肪組織為大鼠腎周和附睪的脂肪組織,用濾紙吸干表面組織液,取部分脂肪組織立即置于Trizol中,按照說明書提取總RNA;另取部分脂肪組織包在錫箔紙中,置-80℃冰箱保存,分別測chemerin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。

    1.5 qRT-PCR檢測內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA表達(dá)

    chemerin的引物:Forward:5'-ATCAAACCAAATGGGAGGAAGC-3'; Reverse:5'-GGGAAGAAGTAGATGCGGGAGTC-3'; β-actin的引物: Forward:5'-CTAGAGGGTGTCCGCAATG-3'; Reverse:5'-CAGTGGGAAGGTGTAGTCAGTC-3'。

    以Trizol法提取內(nèi)臟脂肪組織細(xì)胞總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使全長mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,短暫離心,通過預(yù)變性、變性、退火及延伸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。融解曲線分析:60 ℃~95 ℃環(huán)境下,溫度每次升高0.3℃,時間間隔為5 s,chemerin的Tm值為83℃。根據(jù)上述實驗得出的數(shù)據(jù),軟件自動計算出閾值與Ct值,△Ct= Ct(目的基因)- Ct(β-actin),相對定量采用2-△Ct法。chemerin mRNA基因表達(dá)量結(jié)果采用2-△Ct×1000。

    1.6 Western blot法檢測內(nèi)臟脂肪組織chemerin蛋白表達(dá)

    用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后,用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜放置于封閉液中,滴加一抗(兔抗chemerin抗體)后37℃孵育3 h,室溫下于脫色搖床上用TBST洗4次,10 min/次;然后加入TBS液中,滴加二抗37℃孵育1 h,室溫下于脫色搖床上用TBST洗5次,10 min/次。進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),在顯影液中沖洗膠片,之后放入定影液中漂洗10 s;用水沖洗后室溫靜置晾干。掃描膠片,測定目的條帶的凈吸光度值。

    1.7 ELISA檢測血漿chemerin濃度和胰島素濃度

    采用ELISA(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)的雙抗體夾心法,測定大鼠血漿標(biāo)本中chemerin和胰島素濃度。在Excel工作表中,橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,縱坐標(biāo)為相對應(yīng)的A值,得出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線。chemerin濃度值:曲線方程為y=0.039x-0.026,標(biāo)準(zhǔn)品試劑測量值與實際測量值相關(guān)系數(shù)r=0.999。胰島素濃度值:曲線方程為y=0.020x+0.008,標(biāo)準(zhǔn)品試劑測量值與實際測量值相關(guān)系數(shù)r=0.999。把該方程代入Excel工作表中,得到相應(yīng)的濃度值,再乘以5為樣本實際濃度。以胰島素敏感性指數(shù)(insulin sensitivity index,ISI)反映胰島素敏感性,ISI計算公式:ISI=1/[log(I0)+log(G0)],I0代表空腹胰島素含量(μU/ml),G0代表空腹血糖濃度(mmol/L)[9]。

    1.8 統(tǒng)計方法

    2 結(jié)果

    2.1 老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化

    chemerin mRNA表達(dá):OC組呈現(xiàn)高于C組的趨勢(P>0.05),OE、TO組與OC組無統(tǒng)計學(xué)差異,OET組呈低于OC、OE、TO組的趨勢(P>0.05,表1)。chemerin 蛋白質(zhì)表達(dá):OC組與C組無明顯差異(P>0.05);OE、TO組均低于OC組(P<0.05);OET組明顯低于OC、OE、TO組(P<0.01,表1,圖1)。

    GroupnChemerin mRNAChemerin proteinC51.612±0.2570.911±0.020OC51.767±0.1121.057±0.075**OE61.744±0.2550.857±0.080**#TO51.763±0.2870.870±0.074**#OET61.518±0.2720.586±0.013

    C: Control group; OC: Obese control group; OE: Obese exercise group; TO: Turtle oil group; OET: Obese supplement of turtle oil combined with exercise group

    **P<0.01vsOET group;#P<0.05vsOC group

    2.2 老年肥胖大鼠血漿chemerin 濃度、血糖水平及ISI的變化

    血漿chemerin濃度:OC組明顯高于C組(P<0.01);TO、OE、OET組均明顯低于OC組(P<0.05,P<0.01)。血糖水平:OC組高于C組(P<0.01);TO、OE、OET組均低于OC組(P<0.05)。ISI:OC組低于C組(P<0.05);OE、TO、OET組均明顯高于OC組(P<0.01,表2)。

    Fig.1Comparision of chemerin protein expression of rats among groups

    GroupnChemerin concentration(μg/L)Blood sugar(mmol/L)ISIC516.692±1.54511.636±3.5680.395±0.019OC519.051±0.927**17.930±6.094**0.369±0.017*OE616.261±0.981##12.842±1.905#0.396±0.015##TO517.308±1.022#12.550±2.669#0.397±0.016##OET616.389±0.609##12.933±1.203#0.399±0.008##

    C: Control group; OC: Obese control group; OE: Obese exercise group; TO: Turtle oil group; OET: Obese supplement of turtle oil combined with exercise group

    *P<0.05,**P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsOC group

    3 討論

    chemerin是近年來研究肥胖相關(guān)代謝疾病的熱點之一。研究指出[10],高脂膳食飼養(yǎng)大鼠的內(nèi)臟脂肪組織中chemerin mRNA表達(dá)明顯高于正常大鼠。肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織中chemerin蛋白質(zhì)表達(dá)、血漿chemerin水平均高于自然生長大鼠[11]。運動能夠減少肥胖鼠和瘦鼠的脂肪量、減低肥胖基因(ob)mRNA水平,運動增加能量消耗,使ob基因?qū)δ芰肯脑黾拥姆磻?yīng)性表達(dá)降低,使體重維持在一個相對穩(wěn)定的水平[12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),有氧運動干預(yù)后,高脂膳食大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低[13]。甲魚油作為一種食用油脂,富含多種不飽和脂肪酸,尤其是二十二碳六烯酸(decosahexaenoic acid, DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)能夠調(diào)節(jié)血脂、抗高血壓、維持糖代謝的穩(wěn)定,可以改善大鼠肝臟中相關(guān)基因mRNA表達(dá)量[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn),老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)呈現(xiàn)高于正常老年大鼠的趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,可能是由于大鼠樣本數(shù)偏少、飼養(yǎng)方式和飼養(yǎng)環(huán)境等條件所導(dǎo)致,未來將進(jìn)一步深入研究。運動與甲魚油干預(yù)后,chemerin蛋白質(zhì)表達(dá)明顯低于單純運動干預(yù)和單純甲魚油干預(yù),提示運動結(jié)合甲魚油的干預(yù)效果更明顯,二者有明顯的協(xié)同性。

    肥胖患者有糖、脂代謝異常,血糖水平高于正常人,且維持血糖平衡的能力降低,血糖下降速度變慢,胰島素分泌增多[16]。有規(guī)律的運動和低脂膳食干預(yù)能有效促進(jìn)機(jī)體糖的利用和轉(zhuǎn)化,降低血糖和血脂水平,顯著提高其ISI,改善內(nèi)分泌和新陳代謝[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn),老年肥胖大鼠血漿chemerin濃度和血糖水平明顯升高,ISI降低。通過運動和/或甲魚油的干預(yù),血漿chemerin濃度和血糖水平明顯下降,ISI改善;但運動和甲魚油的干預(yù)無協(xié)同性。說明運動和/或甲魚油干預(yù)能夠明顯改善老年肥胖大鼠血漿chemerin水平,是否通過血漿chemerin水平的降低來改善ISI,進(jìn)而降低血糖水平尚需進(jìn)一步研究。

    綜上所述,老年肥胖大鼠血漿chemerin濃度及血糖水平增高,胰島素敏感性降低;運動結(jié)合甲魚油能明顯降低老年肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織chemerin蛋白質(zhì)表達(dá),降低血漿chemerin濃度及血糖水平,提高胰島素敏感性。推測運動結(jié)合甲魚油干預(yù)可能是改善老年肥胖和預(yù)防肥胖相關(guān)疾病的有效手段。

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