腦缺血和缺血再灌注大鼠皮層神經(jīng)元自噬的動態(tài)變化*

陶紅苗， 單小云， 李旭升， 陳浩浩， 毛宇飛， 何忠平

(1. 金華職業(yè)技術學院， 2. 金華市中心醫(yī)院， 3. 金華市食品藥品檢驗檢測研究院， 浙江 金華 321000)

缺血性腦卒中是全球主要的致死及致殘疾病之一[1]，在有效時間窗內(nèi)恢復缺血腦組織的血液灌注是目前缺血性腦卒中的唯一有效治療策略。然而，血流再灌卻造成腦缺血再灌注損傷，極大地影響缺血性腦卒中的臨床治療。腦缺血損傷的病理機制尚未完全闡明，有證據(jù)表明細胞自噬可能在其中發(fā)揮了重要的作用[2-5]。細胞自噬是一種細胞通過自噬溶酶體途徑降解細胞內(nèi)容物的過程。正常情況下，細胞內(nèi)維持著低水平的自噬；當受到營養(yǎng)缺乏、低氧和炎癥等刺激后細胞內(nèi)自噬可被激活[6]。諸多文獻報道大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后自噬溶酶體途徑被激活，自噬通過降解損傷線粒體、清除炎癥物質等機制發(fā)揮神經(jīng)保護作用[7,8]；但是，自噬溶酶體途徑的過度激活可能將胞漿物質和細胞器“消化”掉，造成細胞內(nèi)環(huán)境紊亂和能量耗竭，引發(fā)細胞凋亡程序的啟動，導致細胞死亡加重了缺血損傷[9]。自噬在腦缺血損傷過程中究竟發(fā)揮了什么樣的作用，目前結論不一。有學者認為自噬如同一把雙刃劍，腦缺血不同時期的自噬對神經(jīng)細胞的轉歸有截然不同的作用[8]。而且有研究表明，在缺血再灌注損傷中施加藥物、缺血后處理等調控因素可以有效減輕其損傷程度，而且調節(jié)神經(jīng)細胞自噬水平是主要治療機制之一，提示自噬是一種潛在的腦缺血損傷治療靶點[9-14]。因此，了解自噬水平變化規(guī)律可以為臨床治療腦缺血再灌注損傷提供可靠的實驗依據(jù)和理論基礎。

本實驗通過建立局灶性大鼠腦缺血和腦缺血再灌注模型，在不同時間點分別采用Western印跡法測定大腦皮層腦組織中微管相關蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3，LC3-Ⅱ)的水平，并進一步通過透射電鏡檢測大腦皮層神經(jīng)細胞自噬情況，探討局灶性腦缺血和缺血再灌注所誘導大鼠腦皮層神經(jīng)細胞的自噬變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 動物

普通級雄性健康SD大鼠60只，體重(250～280) g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2012-0002，動物合格證號為0267760。

1.2 主要試劑及材料

栓線(北京沙東生物有限公司，2634-A4型)；LC3-Ⅱ抗體(ab128025，英國Abcam公司)；GAPDH(MAB5465，聯(lián)科生物)、山羊抗兔Ⅱ抗(GAR0072，聯(lián)科生物)。TECNAI 10 透射電鏡。

1.3 動物分組及模型制備

取健康雄性SD大鼠60只，隨機分為假手術(Sham)組(n=10)、腦缺血和缺血/再灌注模型組(n=50)。大鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠。Sham組僅單純暴露右側頸總、頸內(nèi)和頸外動脈，不做其他任何處理。模型組大鼠采用Longa等[15]改良線栓法制作右側大腦中動脈栓塞(right middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型：頸部正中切口，分離右側頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈；結扎頸外動脈遠心端，用血管夾暫時夾閉頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈；在頸外動脈靠近頸總動脈分叉處剪1小口，插入一特制線栓(其一端用硅膠包被)，松開頸內(nèi)動脈上的血管夾，將線栓輕輕由頸外動脈插入頸內(nèi)動脈，直至線栓堵塞大腦中動脈的起始部，線栓插入長度一般為18～20 mm，扎緊線栓，再松開頸總動脈上的血管夾。模型組于缺血30 min、2 h和缺血2 h再灌注1 h、6 h、24 h五個時間點分別隨機抽取10只大鼠：缺血30 min及2 h大鼠不拔出線栓，直接處死并取材；缺血2 h再灌注1 h、6 h、24 h組大鼠，于缺血2 h后拔出線栓(即開始再灌注)，再灌注1 h、6 h和24 h時處死大鼠并取材。各組大鼠模型如未能存活至預計時間點，則重新制作模型補足。大鼠蘇醒后，依據(jù)Zea longa 5分制標準(無神經(jīng)功能缺損癥狀、活動正常者為0分；不能伸展對側前爪者為1分；爬行時出現(xiàn)向左轉圈者為2分；行走時身體向偏癱側傾倒者為3分；不能自發(fā)行走，意識喪失者為4分)，篩選出2分或3分的具有典型腦缺血癥狀的大鼠模型進入后續(xù)實驗，剔除其余動物以保證入組動物均造模成功。所有大鼠造模后均無死亡，造模成功率80%。

1.4 標本的采集和保存

每個時間點各組隨機抽取4只大鼠，腹腔注射水合氯醛麻醉并處死大鼠，迅速斷頭取腦組織，去除嗅球、小腦和低位腦干，取右側大腦半球組織標本，用于腦梗死體積測定。其余6只大鼠處死后迅速用預冷的生理鹽水及4%福爾馬林溶液(溶于生理鹽水)恒壓貫序體循環(huán)灌流固定，以梗死區(qū)腦組織為中心，分別取材并用于以下指標檢測：取約2 mm厚的腦組織稱濕重后用于含水量檢測；另取小塊腦組織迅速放入液氮，再轉入-80 ℃冰箱保存，用于Western印跡檢測；隨機選取3只大鼠，于海馬位置冠狀位切一塊腦組織浸入4%甲醛固定，用于病理學檢查，并切取1 mm3皮層組織浸入2.5%戊二醛固定，用于透射電鏡檢查。

1.5 TTC法檢測腦梗死體積

沿冠狀面將右側大腦半球切片，片厚約2 mm，迅速將腦片置于2%TTC-PBS中，37 ℃避光孵育30 min，不時翻動腦片使之與染液均勻接觸。正常腦組織染成深紅色，梗死區(qū)為白色(不著色)。染色后棄去染液，將腦片放入4%甲醛中固定24 h，數(shù)碼相機拍照，將圖像輸入計算機，用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0計算腦梗死體積百分比。為減少由腦水腫產(chǎn)生的誤差，采用以下公式計算大腦梗死體積百分比(%)=(缺血對側半球體積一缺血側非梗死體積)/缺血對側半球體積×100%[16]。

1.6 干濕法測定腦組織的含水量

取病變側約2 mm厚的腦組織稱濕重，放入95 ℃烤箱內(nèi)烘干24 h至恒重后取出恢復到室溫，稱干重。腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

1.7 腦組織的病理學觀察

將沿海馬位置冠狀位切取的腦組織浸入4%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、HE染色制片，觀察腦組織病理學變化。

1.8 Western印跡法檢測LC3-Ⅱ的蛋白質水平

將腦組織稱重后剪碎勻漿，加入細胞裂解液裂解，離心，取上清采用BCA法測定蛋白質濃度，-80 ℃冰箱保存。取適量蛋白質樣本按常規(guī)方法進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將凝膠上分離得到的蛋白質條帶轉印至PVDF膜上，然后分別用非標記I抗(抗LC3-Ⅱ抗體)及Ⅱ抗(山羊抗兔IgG)對其進行孵育、檢測。用Image J圖像分析軟件分析灰度值，以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值為其相對表達水平。

1.9 透射電鏡觀察腦組織的自噬情況

取1 mm3皮層腦組織，置于2.5%戊二醛溶液中固定過夜。磷酸緩沖液沖洗后，用1%鋨酸固定1 h；梯度乙醇、丙酮脫水，純包埋劑包埋。將超薄(120 nm)切片經(jīng)鈾、鉛雙染色后上單孔銅網(wǎng)，透射電鏡下觀察自噬泡并拍照。自噬體和自噬溶酶體的判斷標準參考相關指南[17]：自噬體為雙層膜結構(至少可見部分雙層膜結構)，內(nèi)含結構完整的細胞器；自噬溶酶體為單層膜結構，內(nèi)含處于不同消化階段的細胞器或胞質成分。由于有時很難嚴格區(qū)分自噬體和自噬溶酶體，經(jīng)常將二者統(tǒng)稱為自噬泡。

1.10 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 腦梗死體積的動態(tài)變化

缺血30 min大鼠無明顯腦梗死，再灌注1 h，6 h，24 h大鼠腦梗死體積隨再灌注時間延長呈增加趨勢，與Sham組相比，再灌注6 h，24 h大鼠腦梗死體積具有統(tǒng)計學差異(P<0.01，圖1、表1)。

2.2 腦組織含水量的動態(tài)變化

缺血30 min、2 h，缺血后再灌注1 h、6 h腦組織含水量呈逐漸增加趨勢，但與Sham組比較均無統(tǒng)計學差異。再灌注24 h腦組織含水量較Sham組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

Fig.1The representative images of the infarcts stained with TTC in each group were showed

a: Sham group; b: Isch 30 min group; c: Isch 2 h group; d: Repe 1 h group; e: Repe 6 h group; f: Repe 24 h group

GroupsInfarct size(n=4)Water content(n=6)Sham079.56±4.98Isch 30 min079.66±3.90Isch 2 h2.75±0.4480.49±4.47Repe 1 h4.70±0.5482.78±3.04Repe 6 h9.75±2.81**82.94±6.39Repe 24 h24.78±3.53**86.49±4.35*

*P<0.05,**P<0.01vssham group

2.3 HE染色觀察大鼠腦組織病理學的動態(tài)改變

Sham組大鼠腦皮層區(qū)和海馬區(qū)結構正常，細胞排列致密規(guī)則，無明顯水腫、細胞變性及凋亡等改變。缺血30 min、缺血2 h時，大鼠大腦皮層均未見明顯病變，海馬區(qū)見少量神經(jīng)元細胞核皺縮、深染呈變性凋亡狀態(tài)。缺血后再灌注1 h、6 h時，大鼠腦皮層未見明顯病理改變，海馬區(qū)見較多神經(jīng)元細胞核皺縮、深染呈變性凋亡狀態(tài)。再灌注24 h時，大鼠腦皮層見組織水腫、疏松，部分細胞變性、凋亡，海馬區(qū)見大量神經(jīng)元細胞核皺縮、深染呈變性凋亡狀(圖2)。

Fig.2The dynamic changes of neurons in cortex and hippocampus after ischemia/reperfusion as determined by HE staining(×200)

a: Sham group; b: Isch 30 min group; c: Isch 2 h group; d: Repe 1 h group; e: Repe 6 h group; f: Repe 24 h group. The arrows in the picture refer to nucleus shrinkage, hyperchromatosis and apoptosis. The circle represents tissue edema and loose structure

2.4 Western blot法檢測MCAO大鼠大腦皮層LC3蛋白質水平的動態(tài)變化

與Sham組比較，缺血30 min大鼠大腦皮層LC3-Ⅱ/Ⅰ比值無明顯差異，缺血2 h該比值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。缺血再灌注1 h、6 h大鼠大腦皮層LC3-Ⅱ/Ⅰ比值雖較缺血2 h有所下降，但仍明顯高于Sham組(P<0.05)；缺血再灌注24 h大鼠大腦皮層LC3-Ⅱ/Ⅰ達到高峰0.43±0.06，明顯高于Sham組(P<0.01，圖3和表2)。

Fig.3The dynamic changes in expression level of LC3-Ⅱ protein in the rat brain cortex detected by Western blot

GroupsLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratioSham0.20±0.09Isch 30 min0.26±0.02Isch 2 h0.37±0.04**Repe 1 h0.32±0.06*Repe 6 h0.30±0.03*Repe 24 h0.43±0.06**

*P<0.05,**P<0.01vssham group

2.5 透射電鏡觀察大鼠腦皮層自噬的動態(tài)變化

Sham組大鼠神經(jīng)元細胞核結構正常，染色質分布較均勻，線粒體脊線清晰，神經(jīng)髓鞘豐富，自噬不明顯。與Sham組相比，缺血30 min大鼠皮層神經(jīng)元染色質有固縮，線粒體有輕度損傷，有1～2個自噬泡；缺血2 h細胞凋亡較明顯，可見較多的自噬泡。缺血/再灌注1 h、6 h時，神經(jīng)細胞凋亡更明顯，自噬泡持續(xù)增多；缺血/再灌注24 h時，神經(jīng)細胞邊界模糊接近壞死，自噬泡在各組別中最多(圖4)。

3 討論

研究表明，自噬是腦缺血過程中的重要細胞生物學事件，腦缺血過程中伴有細胞自噬發(fā)生，且缺血和缺血/再灌注過程中都伴有自噬激活，提示細胞自噬可能與腦缺血過程密切相關[2-5]。盡管自噬在腦缺血過程中的作用仍存在爭議，但最近的研究表明，腦缺血/再灌注過程中的細胞自噬通過清除損傷線粒體進而發(fā)揮了神經(jīng)保護作用[8]。不僅如此，通過藥理學或者缺血后處理等方法調控缺血/再灌注過程中的細胞自噬，可減輕腦缺血損傷[10,18]。這些結果提示，自噬可能是一種抗腦缺血/再灌注損傷的藥物干預新靶點。然而，自噬是一種復雜的細胞生物學過程，腦缺血/再灌注過程中自噬發(fā)生的時相特征尚不完全清楚。因此，了解缺血/再灌注過程中自噬的變化規(guī)律，對進一步尋找自噬干預時間窗具有十分重要的意義。

Fig.4Observation of autophagy in the rat brain cortex by transmission electron microscopy. a: Sham group; b: Isch 30 min group; c: Isch 2 h group; d: Repe 1 h group; e: Repe 6 h group; f: Repe 24 h group. The arrows in the picture refer to autophagic vesicles, and the circle represents chromatin condensation

本研究采用的大鼠大腦中動脈栓塞-再灌注模型是一種常用的動物局灶性腦梗死模型。本實驗結果顯示，再灌注6 h和24 h時大鼠腦梗死體積增加較明顯，再灌注24 h時腦組織含水量增加較明顯，見皮層組織水腫、疏松，部分細胞變性、凋亡，海馬區(qū)可見大量神經(jīng)元細胞核皺縮、深染呈變性凋亡狀。該結果與前人的發(fā)現(xiàn)一致，同時也證實了本實驗模型的可靠性。基于該模型，我們進一步探討了缺血再灌注不同時間點自噬的激活情況。

LC3是自噬標志物。自噬泡成熟時，LC3-I轉變?yōu)長C3-II(即自噬體膜型)，LC3-II/I比值的大小被廣泛用于評估自噬激活的程度。本實驗結果顯示，缺血誘導自噬激活的時間可能在30 min以上，該結果與之前的報道類似[19]。然而，缺血誘導的自噬并未因血流再灌注而終止，再灌注1 h、6 h時自噬持續(xù)升高，再灌注24 h達到高峰。該結果提示，缺血后再灌注同樣是誘導神經(jīng)元自噬的一種重要應激因素。該結果還提示，在缺血后再灌注過程中自噬可能存在著較長的激活時相。透射電鏡是研究自噬最可靠的檢測手段，我們利用透射電鏡對梗死區(qū)周圍大腦皮層組織進行了觀察，進一步證實了上述現(xiàn)象。上述研究均發(fā)現(xiàn)，在局灶性腦缺血再灌注模型中大腦皮層缺血2 h神經(jīng)細胞自噬即明顯激活，再灌注1 h、6 h自噬均持續(xù)增高，再灌注24 h自噬達高峰，提示缺血和缺血再灌注過程中都伴有自噬激活。

在缺血過程中，組織低氧、酸化及能量供應障礙都可能是導致自噬激活的因素，本研究發(fā)現(xiàn)自噬隨缺血時間延長而激活，提示自噬激活可能與病理損傷的程度呈正相關。然而，伴隨著血流再灌注過程，氧化應激損傷是主要病理特征。有文獻報道，氧化應激是激活自噬的重要途徑[6]。腦缺血后的再灌注過程伴隨著氧化應激，在再灌注早期有大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，對組織細胞造成氧化損傷，同時細胞通過多種抗氧化機制清除部分的過氧化物。隨著再灌注的進行，這些半衰期較短的ROS可能通過超氧化物歧化酶的作用形成過氧化氫及脂質過氧化物，后者的半衰期較長，造成組織的持續(xù)氧化損傷。不僅如此，而且細胞的抗氧化機制在再灌注早期已耗竭，會造成氧化應激的第二次增強。本實驗發(fā)現(xiàn)，相比缺血2 h組，缺血后再灌注過程造成的自噬激活呈現(xiàn)先降低、后升高的趨勢，于再灌注24 h達峰值，這可能是再灌注過程中氧化應激導致自噬二次激活的原因。該結果提示，調控缺血再灌注后的氧化應激可能是有效干預自噬的手段之一。

本研究未對再灌注24 h后的情況進行觀察。但有學者[20]采用透射電鏡觀察到，腦缺血再灌注損傷后半暗帶神經(jīng)細胞內(nèi)自噬體形成、溶酶體增多，并持續(xù)到5 d。提示自噬激活可能存在于腦缺血再灌注后的較長時間內(nèi)，這可能為缺血性腦損傷治療提供了一個具有更長時間窗的治療策略。有研究利用永久性腦缺血大鼠模型發(fā)現(xiàn)，缺血1 h半暗帶自噬就開始激活，缺血5 h自噬達高峰，而缺血性腦卒中24 h時自噬活性明顯下降而凋亡激活，認為可能發(fā)生了從自噬到凋亡的轉變[19]。這提示，在不同腦缺血大鼠模型中自噬激活的規(guī)律存在差異，在將自噬作為腦卒中治療靶點時，需要充分考慮到這一點。

綜上所述，本研究通過大鼠在體腦缺血和缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)大腦皮層缺血2 h神經(jīng)細胞自噬即明顯激活，缺血后再灌注1 h、6 h時自噬均持續(xù)增高，缺血后再灌注24 h時自噬達高峰，為自噬干預提供了理論依據(jù)。