蘋果多酚通過下調(diào)鈣敏感受體改善大鼠低氧性肺動脈高壓的作用*

孟涵燕， 趙 潔， 花春艷， 朱星諭， 李依玲， 袁琳波△

(1. 溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室， 浙江溫州 325000)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一類以肺動脈壓力進行性升高為特征的心肺血管疾病，是慢性肺源性心臟病、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、肺栓塞、睡眠呼吸暫停綜合征(sleep apnea syndrome,SAS)等多種心肺疾病的重要病理生理環(huán)節(jié)，在臨床上表現(xiàn)為肺動脈阻力持續(xù)性升高，導(dǎo)致右心室肥厚、擴張乃至右心衰竭，是當今最重要的國際性醫(yī)療問題之一[1,2]。

目前，治療肺動脈高壓的措施主要包括吸氧、利尿、擴張肺血管等，常用藥物有前列環(huán)素及其衍生物、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑、鈣離子拮抗劑等。這些藥物可在一定程度上緩解肺動脈高壓的癥狀，減慢肺血管重構(gòu)的進程，但不能根治肺動脈高壓，而且這些藥物靶向性低、吸收率差，存在較多的副作用，治療效果并不理想[3,4]。

蘋果多酚是一種具有強抗炎、抗氧化生物活性的天然化合物，來源廣泛，毒副作用小。第一，蘋果多酚作為一種氧化還原電位很低的還原劑，能清除多種活性氧，減少氧自由基的生成；第二，可減弱金屬離子對氧化還原反應(yīng)的催化作用，抑制氧化酶活性，間接清除自由基；第三，抑制受到抗原刺激的肥大細胞釋放組胺，抑制透明質(zhì)酸酶活性，有效抑制機體的炎癥反應(yīng)[5]?，F(xiàn)階段我國對蘋果多酚的開發(fā)利用尚處于初始階段，且主要應(yīng)用于食物的抗氧化保存、美容養(yǎng)顏等領(lǐng)域，醫(yī)藥方面的功能性研究仍然有很大的擴展空間。將水果中的天然成分——蘋果多酚用于肺動脈高壓的預(yù)防，具有較大的意義。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

SPF級雄性SD大鼠36只，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，體重(180～200)g。蘋果多酚購自上海源葉生物技術(shù)公司；RIPA裂解液(碧云天)，BCA試劑盒(Pierce)，anti-CaSR抗體(Abclonal)，GAPDH抗體(Abclonal)，HRP標記的羊抗兔IgG(Santa Cruz)，SDS-PAG制備試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 肺動脈高壓模型的構(gòu)建

36只大鼠按體重從大到小排序，按隨機數(shù)字表法隨機分成3組(n=12)：對照組(A組)，低氧誘導(dǎo)組(B組)，蘋果多酚干預(yù)組(C組)。A組大鼠在正常環(huán)境下飼養(yǎng)，B、C組大鼠每天在常壓低氧艙(氧濃度為10%)中間斷性低氧飼養(yǎng)8 h，之后打開低氧艙更換飼料、水及墊料，為期四周。在模型構(gòu)建的開始，C組大鼠每日用蘋果多酚按200 mg/kg灌胃，A、B兩組用等量生理鹽水灌胃，共持續(xù)四周。常壓低氧裝置為自制簡易低氧艙，內(nèi)置測氧儀，通過調(diào)節(jié)氮氣流量控制艙內(nèi)氧氣濃度為10%，艙底放置鈉石灰和無水氯化鈣以吸收艙內(nèi)二氧化碳和水分。建模完成后，首先檢測血流動力學(xué)指標，進而對36只大鼠進行剖胸取血，分離得到血清和血漿；灌肺并收集灌洗液，-80 ℃保存待用；取各葉肺組織待用；取大鼠的心臟待用；剝離股骨、脛骨，用于抽取骨髓。在此基礎(chǔ)上，分別檢測各大鼠的肺動脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure, mPAP)、肺血管阻力(pulmonary vascular resistance, PVR)、右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index, RVHI)、肺動脈中膜厚度(medial thickness，MT)、管壁面積占血管總面積百分比(wall area as a percentage of total vascular area，WA%)、管壁厚度占血管外徑百分比(percentage of wall thickness to vascular diameter ，WT%)、肺動脈組織中鈣敏感受體(calcium sensitive receptor, CaSR)表達量。

1.3 肺血流動力學(xué)指標檢測

大鼠稱重，烏拉坦麻醉，沿右頸外靜脈行肺動脈插管，最后將插管末端通過血壓壓力換能器連接至PowerLab生物信號采集分析系統(tǒng)，讀取mPAP數(shù)值。用心輸出量(cardiac output, CO)檢測儀(ml313C, AD Instruments)和PowerLab/4SP生物信號記錄分析系統(tǒng)測量CO。根據(jù)上述生物信號采集記錄分析系統(tǒng)PowerLab/4SP測量得到的mPAP和CO，按下式計算ΔPVR：ΔPVR=mPAP/CO。

1.4 動物處理

血流動力學(xué)指標檢測結(jié)束后，大鼠稱重。烏拉坦麻醉后剖胸，剪開左心耳，向肺靜脈灌注生理鹽水，直至肺變成白色，剪斷氣管取出肺。剝離氣管后處理各肺葉：左肺上葉的肺組織經(jīng)研磨、離心，備提蛋白質(zhì)；左肺下葉用多聚甲醛固定后進行石蠟包埋。其余肺組織及心臟保存于4 ℃冰箱中待用。

1.5 右心室肥厚指數(shù)測定

用生理鹽水清洗大鼠心臟后，用眼科剪自肺動脈沿右心室邊緣游離并剪切右心室壁，將剩余心臟的結(jié)締組織和血管清除干凈即為室間隔和左心室部分，分別進行稱重。按下式進行計算：RVHI=RV/(LV+S)。(RV：右心室游離壁厚度，LV：左心室游離壁厚度，S：室間隔厚度)。

1.6 HE染色

將肺組織進行石蠟包埋、切片。將組織切片置60 ℃烤箱中2 h，過兩次二甲苯(每次10 min)；無水乙醇、95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精依次浸泡3 min；用雙蒸水浸泡5 min后，置蘇木素中染色3 min；用雙蒸水沖洗數(shù)秒鐘后，置0.5%鹽酸酒精中脫分化數(shù)秒，然后將切片浸泡于雙蒸水中20 min；取出切片，放入伊紅染液中10 min。取出切片，用雙蒸水沖洗1 min后風干，中性樹脂封片；用顯微鏡觀察。

1.7 WA%和WT%的測定

采用病理圖像分析軟件Image-pro Plus，分別測出血管環(huán)的外周長P1、內(nèi)周長P2、管總面積A1、管腔面積A2、血管環(huán)外環(huán)的平均直徑D1、內(nèi)環(huán)的平均直徑D2，再根據(jù)公式計算得到WA%和WT%數(shù)值。

WA%=管壁面積/管總面積=(A1-A2)/A1

WT%=血管壁厚度/血管環(huán)外周長=(D1-D2)/P1

1.8 Western Bolt檢測CaSR的表達

配制含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑(1 ml抽提試劑中加入5 μl蛋白酶抑制劑混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液)。稱重250 mg組織放入EP管中，加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑1 ml。用勻漿器低速勻漿，每次30 s，每兩次勻漿之間冰浴1 min，直至組織完全裂解。勻漿液于預(yù)冷的離心機中14 000×g離心15 min，立即將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中保存待用。以β-actin為標準，測定蛋白質(zhì)濃度，制備凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，滴加一抗孵育過夜，滴加HRP標記二抗孵育2 h，曝光檢測熒光強度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 蘋果多酚對低氧誘導(dǎo)大鼠肺血流動力學(xué)及右心室肥厚指數(shù)的影響

低氧誘導(dǎo)組大鼠mPAP為(57.60+3.23) mmHg、PVR為(727.03+4.57) mmHg×min/L，較對照組mPAP(20.28+0.71) mmHg、PVR(222.37+16.58) mmHg×min/L明顯升高(P<0.01)，而蘋果多酚干預(yù)組mPAP為(36.08+2.12) mmHg、PVR為(399.70+137.42) mmHg×min/L，均較低氧誘導(dǎo)組明顯降低，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

Fig.1Effects of applephenon on pulmonary hemodynamics of hypoxia-induced rats(n=12)

Con: Control group; Hypo: Hypoxia-induced group; APP+Hypo: Applephenon-intervented group

**P<0.01vshypoxia-induced group

對照組RVHI為(0.223±0.009)，低氧誘導(dǎo)組為(0.281±0.053)，蘋果多酚干預(yù)組為(0.224±0.025)。與對照組比較，低氧誘導(dǎo)組RVHI明顯增加；與低氧誘導(dǎo)組比較，蘋果多酚干預(yù)組RVHI明顯降低(P<0.01，圖2)。

Fig.2Effects of applephenon on right ventricular hypertrophy index of hypoxia-induced rats(n=12)

Con: Control group; Hypo: Hypoxia-induced group; APP+Hypo: Applephenon-intervented group

**P<0.01vshypoxia-induced group

2.2 蘋果多酚對低氧誘導(dǎo)大鼠肺微小動脈重構(gòu)的影響

如HE染色圖片所示：與對照組比較，低氧誘導(dǎo)組大鼠動脈管壁明顯增厚，而蘋果多酚干預(yù)組大鼠動脈管壁厚度與對照組差別不明顯(圖3)。對照組的WA%和WT%分別為(65.3±10.5)%和(5.5±1.4)%，低氧誘導(dǎo)組的WA%和WT%分別為(80.6±13.1)%和(8.1±2.5)%，蘋果多酚干預(yù)組的WA%和WT%分別為(69.6±15.8)%和(6.4±2.6)%。與對照組比較，低氧誘導(dǎo)組WA%和WT%分別增加至其1.2倍和1.5倍(P<0.01)，而蘋果多酚干預(yù)組升高不明顯(圖4)。

Fig.3HE staining pattern of lung tissue(×200)

A: Control group； B: Hypoxia-induced group； C: Applephenon-intervented group

Fig.4WA% and WT% of small pulmonary vessels(n=12)

Con: Control group; Hypo: Hypoxia-induced group; APP+Hypo: Applephenon-intervented group

**P<0.01vshypoxia-induced group

2.3 CaSR的表達

對照組CaSR為(0.133±0.021)，低氧誘導(dǎo)組為(0.308±0.061)，蘋果多酚干預(yù)組(0.179±0.017)。與對照組相比，低氧誘導(dǎo)組增加至其2.3倍(P<0.01)，而蘋果多酚干預(yù)組為其1.3倍(P<0.05，圖5)。

Fig.5Effects of applephenon on the expression of calcium sensitive receptor (CaSR)of hypoxia-induced rats(n=12)

Con: Control group; Hypo: Hypoxia-induced group;

App+Hypo: Applephenon-intervented group

*P<0.05,**P<0.01vshypoxia-induced group

3 討論

肺動脈高壓是多種心肺疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理環(huán)節(jié)，由于目前尚無根治肺動脈高壓的有效藥物，肺動脈高壓患者的病情呈進行性惡化趨勢[2]。肺動脈高壓的發(fā)生機制非常復(fù)雜，至今尚未完全闡釋清楚，嚴重制約了肺動脈高壓治療的進展。在眾多機制中，較為公認的是炎癥和過氧化機制，其中肺血管收縮增強與肺血管結(jié)構(gòu)重建是其共同的病理生理變化。炎性因子和氧自由基釋放增加，導(dǎo)致肺動脈平滑肌細胞損傷、凋亡和脫落，進而使血管舒張因子(如NO、前列環(huán)素等)和血管收縮因子(如ET-1，血栓素等)平衡失調(diào)，血管平滑肌促有絲分裂和抗有絲分裂失衡，肺動脈中膜平滑肌細胞增殖，肺動脈肌性血管層增厚，無肌性血管層出現(xiàn)肌層及內(nèi)膜新生和叢狀病變，從而導(dǎo)致肺血管的收縮和重構(gòu)，最終致肺動脈高壓形成[6-8]。本實驗結(jié)果顯示，SD大鼠間斷低氧暴露4周后，出現(xiàn)典型的低氧性肺動脈高壓，表現(xiàn)為大鼠肺動脈平均壓、肺血管阻力、右心室肥厚指數(shù)、肺動脈中膜厚度、WA%和WT%指數(shù)、肺動脈組織中CaSR表達量均較對照組明顯升高，而應(yīng)用蘋果多酚進行干預(yù)后，上述變化得到明顯改善。

最新研究發(fā)現(xiàn)，細胞外CaSR與促代謝性谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor，mGluR)、γ-氨基丁酸B受體(GABAB receptors)、味覺受體第一家族(T1R)1～3及孤兒G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)一起，組成了化學(xué)感應(yīng)系統(tǒng)中的GPCRs C家族。該家族能感應(yīng)細胞外Ca2+濃度的改變，介導(dǎo)與之相關(guān)聯(lián)的細胞活動。Guo等[9]認為，肺動脈平滑肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，是肺血管收縮的主要原因，是肺動脈平滑肌細胞遷移和增殖的重要刺激因素，進而引起肺血管重構(gòu)以及PVR增加，如利用鈣拮抗劑抑制平滑肌細胞膜Ca2+內(nèi)流，可有效緩解肺動脈高壓。Smith等[10]認為，PAH患者肺動脈平滑肌細胞Ca2+信號的增強主要表現(xiàn)為以下幾個方面：靜息狀態(tài)下細胞內(nèi)Ca2+濃度增加、增強儲存Ca2+的進入、上調(diào)受體操縱的Ca2+進入，其中上調(diào)CaSR是PAH患者增強Ca2+信號通路、增強肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)增殖的主要機制。Peng等[11]研究發(fā)現(xiàn)，肺動脈高壓動物模型CaSR的競爭性拮抗劑——NPS2143，可以防止肺動脈高壓和右心室肥厚的發(fā)生。本團隊實驗也證實：PAH患者PASMC細胞外CaSR高表達，而蘋果多酚能有效調(diào)控肺動脈平滑肌上CaSR的表達量，使其降低并接近于正常水平，從而減少肺動脈平滑肌Ca2+的內(nèi)流，減少Ca2+與肌鈣蛋白結(jié)合，抑制平滑肌興奮-收縮偶聯(lián)，進而緩解肺血管收縮，減弱平滑肌細胞的增殖，抑制動脈管壁增厚，降低肺血管壓力、舒張血管，逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)，有效緩解肺動脈高壓；同時，蘋果多酚通過各種互補機理能保護肺血管內(nèi)皮細胞，清除肺動脈損傷時的炎性因子和氧自由基，使之免遭過氧化作用，阻止肺血管壁平滑肌細胞的增殖和肺血管重構(gòu)，維持心血管壁的完整性。

此外，根據(jù)Wang等[12]與Smith等[10]研究與基因序列分析，發(fā)現(xiàn)小RNA-16 (miRNA-16)與CaSR的mRNA有著8個核苷酸的互補序列，具有高度相關(guān)特異性，即miRNA-16通過調(diào)控PASMCs上CaSR，參與肺動脈高壓的發(fā)生與發(fā)展。若能干擾此通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，就能達到預(yù)防和治療肺動脈高壓的目的。蘋果多酚是否能通過上述途徑從根本上干預(yù)肺動脈高壓有待進一步研究。