不同劑量瑪咖對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)致大鼠運(yùn)動(dòng)性低血糖的保護(hù)作用*

王彥英， 曹建民， 周海濤， 張 靜， 牛衍龍， 王 燦， 李林蔚， 李思琪

(1. 北京物資學(xué)院， 北京 101149； 2. 北京體育大學(xué)， 北京 100084； 3. 北京聯(lián)合大學(xué) 生物化學(xué)工程學(xué)院， 北京 100023)

機(jī)體在運(yùn)動(dòng)中的主要供能物質(zhì)是糖和脂肪酸。糖和脂肪酸二者供能的比例取決于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)(運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度達(dá)到最大攝氧量的75%及以上時(shí))，糖供能的比例可達(dá)到75%～80%。糖在機(jī)體內(nèi)主要以血糖與糖原的形式存在。血糖隨血液循環(huán)流經(jīng)機(jī)體不同組織時(shí)，可以通過(guò)氧化分解提供組織運(yùn)轉(zhuǎn)所需要的能量。糖原主要分布在肝臟與肌肉中，是葡萄糖在機(jī)體內(nèi)的主要儲(chǔ)存形式。正常狀態(tài)下，人體血糖含量保持相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡。長(zhǎng)時(shí)間、大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)中，血糖含量的平衡會(huì)被迅速打破，機(jī)體優(yōu)先使用肌糖原供能。肌糖原大量消耗后，機(jī)體分解肝糖原釋放葡萄糖，以保持血糖穩(wěn)定。但隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)，肝糖原大量消耗，由肝糖原分解釋放入血的葡萄糖大量減少，而骨骼肌依然從細(xì)胞外大量攝取葡萄糖以滿足肌肉收縮對(duì)能量的需要，進(jìn)而引發(fā)了運(yùn)動(dòng)性低血糖。研究表明：糖原耗竭將嚴(yán)重地影響運(yùn)動(dòng)能力，尤其是耐久力。在馬拉松、公開(kāi)水域游泳、自行車(chē)公路賽等運(yùn)動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)于1 h的運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)因運(yùn)動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)、強(qiáng)度大，恢復(fù)時(shí)間短等因素導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性低血糖和體力衰竭。機(jī)體通過(guò)糖異生作用，可以將運(yùn)動(dòng)中產(chǎn)生的大量乳酸轉(zhuǎn)變成葡萄糖，促進(jìn)肌糖原的更新，并防止乳酸中毒的發(fā)生[1]。糖異生作用的增強(qiáng)，有助于避免和延緩長(zhǎng)時(shí)間、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后期出現(xiàn)的由于血糖降低和能量供應(yīng)不足而產(chǎn)生的運(yùn)動(dòng)性疲勞[2]。糖異生過(guò)程受到多種因素的影響，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)作為限速酶對(duì)調(diào)節(jié)糖異生的速度承擔(dān)著至關(guān)重要的作用。如何合理、有效地防控運(yùn)動(dòng)性低血糖的發(fā)生與發(fā)展，已成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。大量研究證明，原產(chǎn)于秘魯?shù)默斂?Lepidiummeyennii，Walp)具有抗疲勞、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等多重藥理作用[2]。本研究以6周遞增負(fù)荷力竭游泳訓(xùn)練建立運(yùn)動(dòng)性低血糖動(dòng)物模型，從優(yōu)化肌糖原和肝糖原的儲(chǔ)備量及改善運(yùn)動(dòng)中糖異生作用關(guān)鍵限速酶PEPCK活性及表達(dá)的角度，探討補(bǔ)充瑪咖對(duì)運(yùn)動(dòng)性低血糖大鼠的保護(hù)作用及其抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用，旨在為其在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

瑪咖(Lepidiummeyennii)，產(chǎn)自云南麗江，購(gòu)自北京同仁堂健康藥業(yè)(福州)有限公司，批號(hào)16022578。將瑪咖干燥至恒重后粉碎，過(guò)200目篩，稱取200 g加10倍水煎兩次，每次60 min，將2次煎液過(guò)濾后合并，濃縮至生藥質(zhì)量濃度2 g/ml，4℃保存?zhèn)溆?。肝、肌糖原試劑?南京建成生物工程研究所，批號(hào)20161221)、PEPCK多克隆抗體(廈門(mén)慧嘉生物技術(shù)公司，批號(hào)20161219)。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

SPF級(jí)42 d齡雄性Wistar大鼠55只，平均體重(196.2±10.7)g [北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，合格證編號(hào)SCXK(京)2006-0008]。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度保持在(22±2)℃，相對(duì)濕度55%～75%，光照時(shí)間隨自然變化。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均以基礎(chǔ)飼料(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供)和蒸餾水常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。將實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后，以20 min/d的運(yùn)動(dòng)量對(duì)其進(jìn)行為期3 d的篩選，淘汰5只不適應(yīng)游泳訓(xùn)練的大鼠。將剩余50只大鼠以數(shù)字隨機(jī)分組法分為5組：靜止對(duì)照組(C組)、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(M組)、運(yùn)動(dòng)+低劑量瑪咖組(LM I組)，運(yùn)動(dòng)+中劑量瑪咖組(LM II組)，運(yùn)動(dòng)+高劑量瑪咖組(LM III組)，每組10只。

1.3 營(yíng)養(yǎng)干預(yù)及訓(xùn)練方案

各組大鼠每天自由攝食、飲水。同時(shí)在訓(xùn)練前5 min采用專業(yè)灌胃器對(duì)LM各組大鼠每天灌胃瑪咖一次。LM各組灌胃劑量分別為0.2，0.4，1.2 g/kg/d，相當(dāng)于成人推薦劑量的5，10和30倍。LM各組大鼠灌胃液體的體積均為5 ml/kg，C組和M組灌胃等體積生理鹽水。C組不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；其他各組進(jìn)行為期42 d的遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練：即第1周進(jìn)行無(wú)負(fù)重訓(xùn)練，第2周進(jìn)行負(fù)荷2%體重訓(xùn)練(運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相當(dāng)于40%～50%最大攝氧量)，第3周進(jìn)行負(fù)荷4%體重訓(xùn)練(運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相當(dāng)于60%～70%最大攝氧量)，第4～6周進(jìn)行負(fù)荷5%體重訓(xùn)練(運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相當(dāng)于75%～80%最大攝氧量)，每次游泳訓(xùn)練均至力竭。以大鼠開(kāi)始游泳至力竭所用時(shí)間測(cè)定力竭運(yùn)動(dòng)能力。力竭標(biāo)準(zhǔn)以大鼠下沉后10 s不露出水面為度。處死前的最后1次訓(xùn)練為無(wú)負(fù)重力竭游泳訓(xùn)練，記錄力竭時(shí)的游泳時(shí)間。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

各組大鼠在最后一次訓(xùn)練后即刻稱重，乙醚麻醉，經(jīng)頸總動(dòng)脈抽取全血5 ml，部分用于測(cè)定血乳酸，其余部分37 ℃自然凝固，血清析出后放入冰箱，置冰箱24 h后4℃、3 000 r/min離心10 min，分離血清。同時(shí)迅速取肝臟及深層股四頭肌，剔除筋膜，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污，濾紙吸干后稱取適量組織，放入玻璃勻漿管口剪碎。按W(g)組織塊重量/V(ml)勻漿介質(zhì)為1/9 的比例加取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(0.9 %的生理鹽水)進(jìn)行勻漿，制成10%的組織勻漿液。勻漿液3 000 r/min低溫離心15 min，分離提取上清液。

采用葡萄糖氧化酶(GOD)法測(cè)定血糖，分別采用免疫組化法和乳酸脫氫酶偶聯(lián)比色法測(cè)定肝細(xì)胞PEPCK表達(dá)及活性，以蒽酮顯色法測(cè)定肝、肌糖原含量。以上各指標(biāo)的測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，計(jì)算公式等詳見(jiàn)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。采用血乳酸分析儀測(cè)定血乳酸水平。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 瑪咖對(duì)大鼠體重及運(yùn)動(dòng)能力的影響

訓(xùn)練結(jié)束后，M組大鼠體重小于C組(P<0.05)；LM各組大鼠體重大于M組(P<0.05)，LM各組間無(wú)顯著差異。M組無(wú)負(fù)重力竭游泳時(shí)間與C組無(wú)明顯差異；LM各組無(wú)負(fù)重力竭游泳時(shí)間則明顯長(zhǎng)于M組(P<0.01)，且LM III組長(zhǎng)于LM I組(P<0.05，表1)。

GroupWeight before training(g)Weight after training(g)Exhaustive swimming time(min)C196.13±10.75426.15±13.9482.53±20.74M195.89±11.21387.73±13.79*73.85±20.61LM I196.09±10.89412.31±13.96#107.15±20.12##LM II195.69±11.63414.51±14.07#109.27±19.83##LM III196.12±10.98416.35±13.68#114.59±20.31##△

C: Control; M: Motion; LM I: Low doseLepidiummeyennii+motion; LM II: Medium doseLepidiummeyennii+motion; LM III: High doseLepidiummeyennii+motion.

*P<0.05vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsM group;△P<0.05vsLM I

2.2 運(yùn)動(dòng)及瑪咖對(duì)大鼠血糖、血乳酸、肝糖原、肌糖原含量的影響

M組血糖含量顯著低于C組(P<0.01)；LM各組血糖含量高于M組(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，且LM III組高于LM I組(P<0.05)。M組肌糖原含量低于C組(P<0.05)，LM各組肌糖原含量高于M組(P<0.05)，LM組間無(wú)明顯差異。M組肝糖原含量低于C組(P<0.01)，LM各組肝糖原含量高于M組(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，LM III組高于LM I組(P<0.05)。M組血乳酸含量顯著高于C組(P<0.01)，LM各組血乳酸含量低于M組(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，而且LM III組低于LM I組(P<0.05，表2)。

2.3 運(yùn)動(dòng)及瑪咖對(duì)大鼠肝細(xì)胞PEPCK活性及PEPCK表達(dá)的影響

M組大鼠肝細(xì)胞PEPCK活性顯著低于C組(P<0.01)；LM各組大鼠肝細(xì)胞PEPCK活性高于M組(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，且LM III組高于LM I組(P<0.05)。M組大鼠肝細(xì)胞陽(yáng)性染色累計(jì)吸光度均值(表示PEPCK表達(dá))顯著低于C組(P<0.01)；LM各組肝細(xì)胞陽(yáng)性染色累計(jì)吸光度均值高于M組(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，且LM III組高于LM I組(P<0.05，表3)。

Tab. 2 Effects of exercise and Lepidium meyennii on the content of blood glucose, muscle glycogen, liver glycogen, and blood lactic acid in n=10)

C: Control; M: Motion; LM I: Low doseLepidiummeyennii+motion; LM II: Medium doseLepidiummeyennii+motion; LM III: High doseLepidiummeyennii+motion.

*P<0.05,**P<0.01vsC group;#P<0.05，##P<0.01vsM group;△P<0.05vsLM I

Groupphosphoenolpyruvate carboxykinase activity(mIU/min/mg)phosphoenolpyruvate carboxykinase expressionC4.1±0.5421.7±127.9M2.6±1.0**239.6±125.3**LM I3.3±0.6#386.7±124.2#LM II3.6±0.4#405.9±123.7#LM III4.2±1.1##△434.4±127.5##△

C: Control; M: Motion; LM I: Low doseLepidiummeyennii+motion; LM II: Medium doseLepidiummeyennii+motion; LM III: High doseLepidiummeyennii+motion.

**P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsM group;△P<0.05vsLM I

3 討論

競(jìng)技運(yùn)動(dòng)員在一定訓(xùn)練周期前后的體重變化可以直接有效地反映訓(xùn)練強(qiáng)度對(duì)機(jī)體的影響；力竭時(shí)間則可以反映機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力和抗運(yùn)動(dòng)疲勞能力。正常人空腹血糖值為3.89～6.11 mmol/L，如血糖水平低于2.8 mmol/L，臨床上產(chǎn)生頭暈、惡心、嘔吐、出冷汗等相應(yīng)癥狀，稱為“低血糖”。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中，機(jī)體主要?jiǎng)訂T糖酵解供能系統(tǒng)供能。肌糖原酵解后產(chǎn)生的大量乳酸及自由基堆積在肌肉中，使得肌細(xì)胞膜通透性增加，肌細(xì)胞中的乳酸大量進(jìn)入血液，引發(fā)血乳酸濃度大幅升高。伴隨著運(yùn)動(dòng)的持續(xù)進(jìn)行，運(yùn)動(dòng)肌中的肌糖原被大量消耗(正常情況下人體肌肉中所貯存的肌糖原只足以維持1 h的水平的有氧運(yùn)動(dòng))。由于機(jī)體中肌糖原儲(chǔ)量有限，運(yùn)動(dòng)肌又難以從非運(yùn)動(dòng)肌中獲得糖的能量供應(yīng)，機(jī)體需要通過(guò)增加肝糖原分解，釋放葡萄糖入血以保持血糖的穩(wěn)定。與此同時(shí)，乳酸濃度升高后在肝臟中通過(guò)糖異生轉(zhuǎn)化為葡萄糖重新分解入血也可在一定程度上維持血糖的穩(wěn)定，并可進(jìn)一步防止血液的酸化。由于肝糖原的儲(chǔ)備量遠(yuǎn)少于肌糖原，當(dāng)肌、肝糖原大量耗竭后，而糖異生的速度亦不能滿足大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中糖供應(yīng)的能量需求時(shí)，骨骼肌從細(xì)胞外攝取大量葡萄糖以維持供能，引發(fā)運(yùn)動(dòng)性低血糖。血糖下降引發(fā)運(yùn)動(dòng)肌供氧、供能不足，機(jī)體出現(xiàn)外周疲勞及運(yùn)動(dòng)能力下降。與此同時(shí)，由于大腦僅能依靠葡萄糖供能，血糖水平下降可引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮抑制失調(diào)產(chǎn)生中樞疲勞。2011年衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)瑪咖粉作為新資源食品后，瑪咖被廣泛地應(yīng)用于功能性食品、保健食品、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)食品領(lǐng)域，其功效主要為抗衰老、增強(qiáng)免疫力、緩解體力疲勞。此外，瑪珈在化學(xué)防護(hù)、美容等領(lǐng)域也有所應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)旨在探討瑪咖在緩解運(yùn)動(dòng)疲勞的同時(shí)，能否通過(guò)促進(jìn)糖原合成與儲(chǔ)備，上調(diào)糖異生關(guān)鍵限速酶PEPCK的表達(dá)和活性，促進(jìn)乳酸通過(guò)糖異生作用轉(zhuǎn)化為葡萄糖，有效地抑制和延緩運(yùn)動(dòng)性低血糖的發(fā)生與發(fā)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：42 d遞增負(fù)荷力竭游泳訓(xùn)練后，受訓(xùn)練周期、強(qiáng)度、恢復(fù)時(shí)間等多重因素的影響，大鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝速度加快，肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和體重增長(zhǎng)速度明顯減緩，血乳酸濃度大幅升高，運(yùn)動(dòng)能力下降的同時(shí)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性低血糖和運(yùn)動(dòng)疲勞。而訓(xùn)練前補(bǔ)充不同劑量瑪咖的大鼠，有效地抑制和延緩了長(zhǎng)時(shí)間、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)所致大鼠生長(zhǎng)發(fā)育速度減緩的趨勢(shì)；提高了糖原儲(chǔ)備及PEPCK活性有效地抑制和延緩了運(yùn)動(dòng)性低血糖及運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生與發(fā)展。其機(jī)制主要為：一是瑪咖可能促進(jìn)大鼠的食欲，增加了攝食量，進(jìn)而補(bǔ)充了運(yùn)動(dòng)增加的能量消耗。二是瑪咖中總糖含量高達(dá)19.85%。瑪咖可以作為外源性糖分補(bǔ)充，有效促進(jìn)肝臟和肌肉中的糖原的生成，且尤以肝糖原為甚[3]，補(bǔ)充或延緩運(yùn)動(dòng)對(duì)內(nèi)源性糖的消耗，從而提高機(jī)體內(nèi)糖原儲(chǔ)備。同時(shí)，運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充總糖可以引起腎上腺素等激素的迅速釋放，抑制胰島素的釋放[4]，提高PEPCK活性，促進(jìn)糖異生，避免引發(fā)反射性的低血糖。三是瑪咖中的瑪咖多糖高達(dá)9.51%?，斂Ф嗵强梢杂行У卦鰪?qiáng)運(yùn)動(dòng)后大鼠體內(nèi)乳酸脫氫酶活力，將運(yùn)動(dòng)中過(guò)量產(chǎn)生的乳酸脫氫降解為丙酮酸[5]，維持乳酸相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡。四是補(bǔ)充瑪咖通過(guò)有效地扼制長(zhǎng)時(shí)間、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的大鼠HPG軸功能紊亂及睪酮和皮質(zhì)酮水平的降低，恢復(fù)分泌系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，提高肌肉對(duì)葡萄糖的吸收，促進(jìn)糖異生作用及糖原合成與儲(chǔ)備：(1)瑪咖中富含的支鏈氨基酸可以有效地控制腦組織中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)的濃度[6]，避免大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中過(guò)量產(chǎn)生的5-HT影響下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)的正常分泌，從而保證垂體正常分泌促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和促卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)，并保持二者相對(duì)的動(dòng)態(tài)平衡及對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的協(xié)同作用，進(jìn)而促進(jìn)睪酮的合成與分泌[7]；(2)瑪咖中的瑪咖酰胺、瑪咖烯、生物堿等物質(zhì)具有雄激素樣作用，可有效地促進(jìn)睪酮的合成與分泌[8]；(3)睪丸組織中DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成都需要鋅的參與，鋅對(duì)睪酮的合成及分泌具有重要作用[9]?，斂е袖\元素含量較高，可通過(guò)外源性補(bǔ)充的方式為睪酮的正常合成、分泌及功效發(fā)揮保駕護(hù)航[10]；(4)瑪咖中的亞油酸、α-亞麻酸等不飽和脂肪酸及木脂素類化合物，可以通過(guò)多種途徑，緩解長(zhǎng)時(shí)間、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引發(fā)的睪酮等內(nèi)源性雄激素水平及活性的降低，在提高運(yùn)動(dòng)能力和消除疲勞的同時(shí)促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育[10-12]；(5)皮質(zhì)酮可以有效地促進(jìn)肝外組織蛋白質(zhì)的分解，抑制氨基酸進(jìn)入肝外組織使血中氨基酸含量上升，加強(qiáng)糖異生。補(bǔ)充瑪咖可以有效抑制長(zhǎng)時(shí)間、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的皮質(zhì)酮下降[13]。五是瑪咖中含有黃酮類物質(zhì)、瑪咖酰胺、瑪咖烯、異硫氰酸酯、多糖等大量具有較高抗氧化活性的物質(zhì)，可以增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶活性，有效清除運(yùn)動(dòng)過(guò)程中過(guò)量生成的自由基，避免和延緩脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展，保護(hù)腺體和細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常[14-15]，維持肌細(xì)胞的正常功能，進(jìn)而延緩了疲勞的發(fā)生與發(fā)展，加速了疲勞消除。六是瑪咖中含有一定量的支鏈氨基酸和蛋氨酸、少量的?；撬?、糊精、果糖及鈣、鎂、鋅等多種微量元素[5,6,10]，這些物質(zhì)對(duì)于有效地緩解運(yùn)動(dòng)疲勞和中樞神經(jīng)疲勞具有顯著作用，進(jìn)而保證中樞神經(jīng)有效地調(diào)控體內(nèi)血糖的平衡。

高劑量瑪咖有效抑制和延緩長(zhǎng)時(shí)間、大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性低血糖和運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生與發(fā)展，其機(jī)制可能與促進(jìn)糖原合成與儲(chǔ)備，上調(diào)糖異生關(guān)鍵限速酶PEPCK的表達(dá)，提高PEPCK活性，促進(jìn)糖異生作用有關(guān)。