頭針電刺激對急性腦梗死大鼠CD40、CD40L的影響

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急性腦梗死(ACI)有著極高的致死率和致殘率，嚴(yán)重威脅著人們的健康[1]，是繼惡性腫瘤、心肌梗死后又一嚴(yán)重影響人類健康的疾病[2]。腦梗死后中樞神經(jīng)元受損，給病人帶來諸多問題，因此，積極開展新型有效的治療手段，促進(jìn)中樞神經(jīng)功能的恢復(fù)，降低致死率及致殘率，顯得尤為重要。近年來，隨著對腦血管病研究的深入，頭針治療作為發(fā)病后有效的治療手段之一，早期或者超早期頭針治療對缺血腦組織的保護(hù)及修復(fù)作用和內(nèi)在的作用機(jī)制成為研究的重點(diǎn)，對臨床具有重要指導(dǎo)意義[3]。本研究以CD40、CD40L為切入點(diǎn)，通過頭針電刺激干預(yù)大鼠右側(cè)大腦中動脈閉塞(MCAO)局灶性腦缺血模型，觀察腦組織中CD40、CD40L表達(dá)的變化及神經(jīng)功能缺損情況，探究頭針電刺激對腦梗死可能的作用機(jī)制，為頭針電刺激早期治療提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物及分組 健康雄性Wistar大鼠96只，清潔級，體重240 g～280 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，動物合格證號：[SCXK(鄂)2015 -0005]。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食、飲水，通風(fēng)、自然光照，5只或6只分籠飼養(yǎng)。所有Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為頭針電刺激組、假手術(shù)組和模型對照組，每組又分為1 d組、3 d組、7 d組和14 d組4個亞組，每組8只大鼠，并用苦味酸標(biāo)記編號。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 即用型免疫組化Elivision TM plus試劑盒，購自武漢博士德生物制品有限公司；濃縮型兔抗人CD40與CD40L單克隆抗體(一抗)、酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(二抗)，美國MILLIPORE公司生產(chǎn)，購自上海雅吉生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒，購自福建邁新生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)自行配制；10%水合氯醛，實(shí)驗(yàn)室提供；切片機(jī)(德國ZEISS公司)；光學(xué)顯微鏡；醫(yī)用水浴箱、酶標(biāo)儀、低溫電冰箱；一端經(jīng)過石蠟制備后的漁線(長度：15 mm)；華佗牌一次性無菌針灸針，規(guī)格：0.20 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn)；KDZ -Ⅱ型電針儀(揚(yáng)州市凱達(dá)醫(yī)療設(shè)備)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠模型制備 參照Zea Longa改良線栓法[4]制備右側(cè)大腦中動脈阻塞動物模型。術(shù)前禁食、不禁水24 h，隨后稱重。用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mg/100 g)，大鼠完全麻醉后將其固定于操作臺上，頸部皮膚常規(guī)消毒備皮，沿右頸部正中線切開1.8 cm切口，剪開闊筋膜，顯露右側(cè)胸鎖乳突肌，從胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間向深部分離即達(dá)到頸總動脈鞘，用血管鉗將頸總動脈鞘及皮下組織向兩側(cè)牽開，用玻璃分針小心分離出右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA)；用手術(shù)縫合線結(jié)扎右ECA及CCA近心端，不剪斷ECA，不結(jié)扎翼腭動脈，以動脈夾夾閉ICA；用6號注射器針頭于右CCA結(jié)扎的遠(yuǎn)心端(距CCA分叉處2 mm～3 mm)刺入，導(dǎo)入栓塞線，松開ICA動脈夾，調(diào)整好插線的角度及方向，栓線經(jīng)CCA順利地進(jìn)入ICA，直至右側(cè)大腦中動脈(MCA)的起始部，稍遇到阻力即停止，長度20 mm～22 mm，說明線栓頭部進(jìn)入MCA，阻斷血流，用縫合線系住栓塞線；確認(rèn)無出血后逐層縫合，傷口局部消毒。假手術(shù)組除不結(jié)扎插線其余步驟同上。大鼠蘇醒后，有以下表現(xiàn)即表示造模成功[5]：提尾時左側(cè)前肢內(nèi)收屈曲；右眼Horner征；爬行時向左側(cè)劃圈；左側(cè)肢體的疼痛回縮或消失。有以上表現(xiàn)就可列入實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 干預(yù)方法 頭針電刺激組：參照華興邦制定的《動物針灸穴位圖譜》[6]，選取大鼠的百會穴及大椎穴，大鼠造模成功24 h后，將其俯臥并固定于操作臺上，實(shí)施頭針電刺激治療。具體操作方法：首先常規(guī)皮膚消毒，用0.20 mm×25 mm毫針，取百會向前平刺0.5寸，大椎穴直刺0.5寸，兩穴接入KDZ -Ⅱ型電針儀的正負(fù)兩極，選擇疏密波，留針30 min，刺激時長選為1次/日，每次30 min，依據(jù)術(shù)后時間確定治療療程分別為1 d、3 d、7 d和14 d。其余兩組大鼠每天在相同時間固定于操作臺30 min，不進(jìn)行任何干預(yù)，療程與頭針電刺激組相同。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損評分 治療前及治療后第1天、第3天、第7天和第14天進(jìn)行Bederson神經(jīng)功能缺損評分[7]。0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：不能完全伸展左側(cè)前肢，左腕、肘、肩關(guān)節(jié)屈曲；2分：左肩部側(cè)推抵抗力下降；3分：活動時向左轉(zhuǎn)圈；4分：不能自發(fā)行走，意識障礙。

1.2.4 樣本采集 大鼠在干預(yù)第1天、第3天、第7天和第14天后，先進(jìn)行評分，然后迅速脫臼處死，取出大腦，迅速分離大腦皮層，用冰凍的PBS清洗組織表面血液，取右側(cè)大腦的顳葉組織，石蠟切片，所有蠟塊均連續(xù)切片為4 μm厚度，每個蠟塊切兩張，進(jìn)行HE染色及免疫組化檢測。

1.2.5 腦組織中CD40、CD40L測量 采用免疫組化法[8]測定腦組織中CD40、CD40L的表達(dá)，將已經(jīng)制備好的石蠟切片，脫蠟及水化處理后，加入1 mL EDTA(pH8.0)修復(fù)液修復(fù)抗原，然后每張切片加1滴過氧化酶阻斷劑，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶活性，PBS液沖洗4次，每次2 min，除去PBS液，每張切片加1滴正常非免疫動物血清，室溫下孵育8 min，除去血清，每張切片加入一抗(工作濃度為1∶100)，室溫孵育30 min，PBS液沖洗4次，每次3 min，加入二抗，室溫孵育40 min，PBS液沖洗4次，每次3 min，除去PBS液，DAB顯色，鏡下觀察3 min～10 min，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，PBS液沖洗返藍(lán)，DAB顯色，所有切片脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂封固，每批次均設(shè)陽性對照片1張(由試劑公司提供空白石蠟切片)，PBS液取代一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：CD40、CD40L主要于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，表現(xiàn)為棕黃色至深棕色顆粒細(xì)胞。切片由2名病理科醫(yī)師在雙盲情況下評價結(jié)果，至少隨機(jī)觀察5個高倍鏡視野(×400)。計(jì)分方式[9]：①按顯色細(xì)胞數(shù)計(jì)分，陽性細(xì)胞數(shù)<10%計(jì)1分，陽性細(xì)胞數(shù)為10%～50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞數(shù)>50%計(jì)3分；②按細(xì)胞顯色深淺計(jì)分，無色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分?？偡?jǐn)?shù)按①×②判定結(jié)果，0判斷為(-)，1～2判斷為(+)，3～4判斷為(++)，6～9判斷為(+++)。

2 結(jié) 果

2.1 各組Bederson評分 頭針電刺激組Bederson評分隨治療時間延長而逐漸降低，模型對照組在治療14 d時略有下降。頭針電刺激組與模型對照組比較，治療后第3天、第7天及第14天Bederson評分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明頭針電刺激能顯著改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損情況；頭針電刺激組隨著時間增加Bederson評分降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明頭針電刺激對改善腦梗死大鼠肢體功能有重要作用，且隨著時間延長，肢體功能改善越明顯。模型對照組各時間Bederson評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組不同時間點(diǎn)Bederson評分比較(±s) 分

2.2 各組大鼠腦組織中CD40、CD40L表達(dá)比較 治療后與假手術(shù)組比較，模型對照組大鼠腦組織CD40、CD40L表達(dá)均增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；頭針電刺激組隨著治療時間的延長腦組織中CD40、CD40L表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療14 d后頭針電刺激組與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示頭針電刺激能充分抑制腦梗死大鼠CD40、CD40L的表達(dá)，其中以治療14 d后效果最佳。詳見表2、表3。

組別n治療前治療后1 d治療后3 d治療后7 d治療后14 d頭針電刺激組327.65±0.947.60±0.931)6.72±0.861)5.48±0.771)3.56±0.651)模型對照組 327.79±0.968.82±1.07 7.94±0.98 7.44±0.92 6.87±0.83 假手術(shù)組 323.41±0.651)3.40±0.631)3.27±0.591)3.05±0.541)2.76±0.511) 與模型對照組比較,1)P<0.01。

組別n治療前治療后1 d治療后3 d治療后7 d治療后14 d頭針電刺激組327.28±0.927.07±0.901)6.36±0.841)5.15±0.731)3.09±0.611)模型對照組 327.34±0.937.31±0.94 7.55±0.93 7.13±0.87 6.56±0.82 假手術(shù)組 323.13±0.611)3.05±0.581)2.96±0.561)2.74±0.551)2.48±0.521) 與模型對照組比較,1)P<0.01。

3 討 論

急性腦梗死是各種原因引起的腦血管血流突然減少或者中斷，引起腦血管支配區(qū)域組織缺血缺氧，從而發(fā)生的一系列病理生理變化[10]。目前急性腦梗死的發(fā)病機(jī)制尚未闡明[11]，急性腦梗死引發(fā)的多種復(fù)雜的病理變化包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)及興奮性氨基酸毒性作用等，而炎癥反應(yīng)作為一系列復(fù)雜病理反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，近年來受到研究者的廣泛關(guān)注[12]。在急性腦梗死發(fā)生后，可引發(fā)瀑布式的炎癥級聯(lián)反應(yīng)從而進(jìn)一步加重腦組織損傷，而其中CD40、CD40L信號通路在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[13]。CD40是一種I型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族，通過三聚體的形式表達(dá)在CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面。CD40L是一種屬于TNF家族的Ⅱ型跨膜蛋白，通常以三聚體膜結(jié)合形式表達(dá)在CD4+T細(xì)胞表面及內(nèi)皮細(xì)胞、活化的血小板等非免疫細(xì)胞表面[14]。正常情況下CD40、CD40L呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，而當(dāng)大腦缺血缺氧時，可特異性地激活CD40、CD40L使其高效表達(dá)，放大免疫應(yīng)答并促進(jìn)CD4+T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素 -12(IL -12)分泌，促進(jìn)輔助性Th1細(xì)胞分化白細(xì)胞介素 -2(IL -2)和γ -干擾素(INF -γ)，介導(dǎo)早期炎癥反應(yīng)[15]，還可誘導(dǎo)單核 -巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生白細(xì)胞介素 -1(IL -1)和TNF，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使其分泌大量的INF -γ和其他炎癥細(xì)胞因子，同時CD8+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞輔助下，通過CD40、CD40L系統(tǒng)共刺激信號通路對于激活T細(xì)胞及募集白細(xì)胞進(jìn)入壞死腦組織，導(dǎo)致非特異性破壞自身組織引起炎癥反應(yīng)[16]。本研究中隨著腦梗死的發(fā)生，腦組織中CD40、CD40L水平不斷升高，由此可見檢測CD40、CD40L水平可為腦梗死的治療提供依據(jù)。

目前治療急性腦梗死的主要手段為溶栓、抗凝、護(hù)腦以及對癥治療，針刺作為一種非藥物治療，具有療效顯著、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，古人云：“急則用針，緩則用藥”“藥之不及，針之所為”。《針灸大成》載：“卒暴中風(fēng)，頂門、百會”?！俺踔酗L(fēng)跌倒……不省人事，牙關(guān)緊閉，藥水不下，急以三棱針刺手十二井，當(dāng)去惡血……乃起死回生妙訣”。據(jù)文獻(xiàn)報道針灸可以改善大腦局部血供及神經(jīng)功能，電針治療急性腦梗死療效最好并且存在最佳時間窗[17]。電針通過頭部腧穴，促進(jìn)腦側(cè)支循環(huán)的建立，改善腦組織的血流量，加強(qiáng)腦細(xì)胞的代償能力，可使缺血受損的神經(jīng)突觸數(shù)目得到恢復(fù)，從而改善運(yùn)動功能[18]。

本實(shí)驗(yàn)以CD40、CD40L為切入點(diǎn)，采用頭針電刺激法治療右側(cè)大腦中動脈阻塞急性腦梗死大鼠，頭針電刺激組在急性期進(jìn)行頭針電刺激治療，治療一定時間后進(jìn)行Bederson評分，發(fā)現(xiàn)在治療時間窗為7 d時療效顯著，14 d時更加明顯，模型對照組大鼠肢體功能稍有一定的恢復(fù)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。近年來針灸治療急性腦梗死的作用機(jī)制已從血生化、細(xì)胞凋亡等多個角度進(jìn)行研究[19]，而CD40/CD40L在急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展中居重要地位，本實(shí)驗(yàn)頭針電刺激組中CD40、CD40L的表達(dá)都受到了抑制，以治療14 d時抑制效果最明顯，由此可推斷頭針電刺激治療可以抑制CD40、CD40L的表達(dá)，保護(hù)腦組織。

本實(shí)驗(yàn)對急性腦梗死大鼠進(jìn)行Bederson評分及檢測腦組織中CD40、CD40L的表達(dá)，并對頭針電刺激療法的療程進(jìn)行了探討，結(jié)果表明在頭針電刺激組中Bederson評分及CD40、CD40L的表達(dá)水平均減低，且治療14 d時效果最佳。