奇楠沉香精油揮發(fā)性成分分析及其體外抗炎活性研究

關(guān)鍵詞：奇楠；精油；抗炎；RAW264.7細(xì)胞；信號(hào)通路

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

沉香是瑞香科沉香屬（Aquilaria）或擬沉香屬（Gyrinops）植物含有樹(shù)脂的芯材[1]，主要分布于印度、緬甸、老撾、越南、中國(guó)、柬埔寨、泰國(guó)等亞洲國(guó)家[2]。在我國(guó)，主要分布在廣東、海南、廣西、福建和臺(tái)灣等地區(qū)。沉香作為一種熱帶特色作物，具有抗氧化、鎮(zhèn)痛抗炎、降糖等良好功效[3]。近年來(lái)，隨著沉香的市場(chǎng)需求增加，香農(nóng)們從白木香天然林內(nèi)選育出一類具有優(yōu)良特性的品系，該品系具有結(jié)香早、結(jié)香快、結(jié)香質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，俗稱易結(jié)沉香，即為奇楠沉香。奇楠又稱伽南、伽楠、伽藍(lán)、棋楠等，英文名有Kanankoh、Kyara、Chi-Nan、Qi-Nan 等[4]，其價(jià)格是普通沉香的上百甚至上千倍。隨著奇楠人工培育技術(shù)逐漸成熟，奇楠沉香已初步形成產(chǎn)業(yè)[5]。奇楠沉香與普通沉香的主要區(qū)別在于其香氣更加持久綿長(zhǎng)、質(zhì)地較軟，油脂含量豐富，提取物得率及色酮含量比普通沉香更高[6]。張琳等[7]從奇楠沉香中分離的6-羥基-2-[2-（3-羥基-4-甲氧基苯）乙基]色酮能抑制由LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO 的作用，初步說(shuō)明奇楠沉香具有抗炎活性。

奇楠沉香精油（Qi-Nan essential oil， QEO）作為奇楠沉香最重要的活性成分，具有多種生物活性，但目前針對(duì)QEO 的研究主要集中在成分分析鑒定和簡(jiǎn)單活性評(píng)價(jià)。有研究團(tuán)隊(duì)對(duì)從水蒸氣蒸餾法提取的QEO 進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)其倍半萜類化合物含量差異很大， 分別為76.31%[8] 和90.28%[9]，說(shuō)明QEO 成分可能與品種、品質(zhì)和種植地等因素有關(guān)。余珍[10]對(duì)3 種不同品種的QEO進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)QEO 的主要成分均為倍半萜類、2-（2-苯乙基）色酮類和簡(jiǎn)單芳香族化合物，且具有抑制NO 產(chǎn)生的效果。此外，陳細(xì)欽等[11]對(duì)比了分別用水蒸氣蒸餾和超臨界萃取的普通沉香精油和QEO，結(jié)果表明超臨界萃取的精油抗氧化活性均強(qiáng)于水蒸氣蒸餾精油，并且QEO 對(duì)于LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞存活率的抑制作用最佳，這可能是奇楠沉香中的色酮類成分含量遠(yuǎn)高于普通沉香。在現(xiàn)有關(guān)于QEO 的研究中，已初步證實(shí)其具有抗炎活性，但鮮有對(duì)超臨界CO2 萃取法提取QEO的抗炎活性進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道。

本研究擬以超臨界CO萃取法提取的QEO作為研究對(duì)象，通過(guò)GC-MS 分析QEO揮發(fā)性成分，并對(duì)QEO的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。然后，采用生物信息學(xué)手段對(duì)QEO與炎癥相關(guān)的靶點(diǎn)、主要活性成分及相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)。最后利用LPS 誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型驗(yàn)證QEO的抗炎活性，以期為奇楠沉香產(chǎn)業(yè)的深入開(kāi)發(fā)和高效利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 奇楠沉香木種植于廣東省茂名市茂南區(qū)山閣鎮(zhèn)黃杰村委會(huì)塘尾村（110°57′9.594″E， 21°42′47.5272″N）。小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。DMEM 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液、雙抗（ThermoFisherScientific Gibco ）、脂多糖（ lipopolysaccharide，LPS）購(gòu)自Sigma 公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自Serana 公司；CCK-8 試劑盒、一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒、活性氧（ROS）試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；P65、P-P65、P-IκB-α、IκB-α、β-Actin、二抗購(gòu)自Santa Cruz 公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 氣相色譜質(zhì)譜連用儀，日本島津公司；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)ThermoScientific 公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-TEX 公司；倒置熒光顯微鏡，日本Olympus 公司；電泳系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)，中國(guó)Tanon 公司。

1.2 方法

1.2.1 精油提取和純化 奇楠沉香木粉碎后過(guò)80 目篩，準(zhǔn)確稱取100 g 放入萃取罐。設(shè)置萃取條件為30 MPa，45 ℃，二氧化碳流量為20 L/h，萃取4 h。然后將萃取物放入專用的分子蒸餾中進(jìn)行分離純化，并收集餾出物，即獲得QEO。

1.2.2 成分分析 將QEO 溶解于正己烷中，使用0.22 μm 尼龍膜過(guò)濾，備用。采用HP-5 彈性石英毛細(xì)管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm），進(jìn)樣量為1 μL。分別設(shè)置流速（1.0 mL/min）、分流比（30∶1）、進(jìn)樣溫度（250 ℃）和傳輸線溫度（280 ℃）。起始溫度120 ℃，3 min，然后以3 ℃/min 升至180 ℃，再以10 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min。EI 電離70 eV，離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，掃描方式為全掃描，掃描范圍為35～600 m/z。

1.2.3 DPPH 自由基清除能力 將QEO 溶液與DPPH 的甲醇溶液混合，常溫避光反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm 處的吸光值，記為A。等量的無(wú)水乙醇和DPPH 的甲醇溶液混合作為空白反應(yīng)體系，并測(cè)得吸光值，記為A。以維生素C（Vc）作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH 的清除能力按以下公式計(jì)算：

1.2.4 總抗氧化能力 將FRAP 工作液與QEO充分混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，蒸餾水調(diào)零，于593 nm 處測(cè)其吸光值，VC 作為陽(yáng)性對(duì)照。以FeSO 溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，總抗氧化能力值以Fe²⁺含量表示，單位為μmol/mL。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 在PubChem 網(wǎng)站檢索QEO 的成分Smlies，然后將Smlies 導(dǎo)入SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)校正靶點(diǎn)。以inflammation 為關(guān)鍵詞，在GeneCards、Disgenet、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，結(jié)果采用Venny2.1.0 構(gòu)建韋恩圖，獲取QEO 與炎癥的交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，保存蛋白交互信息文件。使用Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建藥物成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖和蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein-proteininteraction， PPI）。通過(guò)David 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 和GO 富集分析，并使用微生信平臺(tái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞采用DMEM完全培養(yǎng)基（10% FBS 和1%雙抗）于37 ℃、5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.7 細(xì)胞活力測(cè)定 試驗(yàn)組分別加入不同濃度的QEO（1、10、20、50 μg/mL），空白組加入等體積的DMEM 培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。使用CCK-8 法檢測(cè)QEO 對(duì)細(xì)胞毒性的影響：棄除培養(yǎng)液，加入CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱中孵育30 min，采用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定每孔吸光值，計(jì)算細(xì)胞的活力。

1.2.8 NO 含量測(cè)定 試驗(yàn)組加入不同濃度的QEO（1、10、20 μg/mL），培養(yǎng)2 h，無(wú)QEO 為空白組（COG）；然后加入終濃度為1 μg/mL 的LPS 刺激24 h，COG 中加入LPS 處理為模型組（MOG）。取上清液并依次加入NO 含量檢測(cè)試劑，測(cè)定540 nm 處的吸光值，根據(jù)NO 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

1.2.9 NO 熒光強(qiáng)度測(cè)定 如1.2.8 處理細(xì)胞后，吸取并棄除培養(yǎng)基，加入濃度為5 μmol/L 的DAFFMDA，37 ℃孵育30 min 后，用PBS清洗3次。利用倒置熒光顯微鏡拍照并記錄細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.10 活性氧（ROS）含量測(cè)定 如1.2.8 處理細(xì)胞后， 吸取并棄除培養(yǎng)基。加入濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA 工作液，37 ℃避光孵育30 min 后，用PBS 清洗3 次。利用倒置熒光顯微鏡拍照并記錄細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.11 ELISA 檢測(cè)炎癥因子含量 細(xì)胞處理同1.2.8。使用ELISA 試劑盒對(duì)培養(yǎng)基中炎癥因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.12 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞處理同1.2.8。使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞后加入裂解液在冰上進(jìn)行快速裂解，然后進(jìn)行4 ℃、13000g高速離心，吸取上清備用。調(diào)整蛋白濃度后進(jìn)行變性即獲得蛋白樣品。然后通過(guò)電泳和轉(zhuǎn)膜將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，并采用常溫封閉（1 h）、一抗（4 ℃過(guò)夜）和二抗（常溫，1 h）孵育得到目標(biāo)蛋白條帶。最后采用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。

1.3數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)重復(fù)3次以上，各組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，使用Origin 2021和Prism 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 奇楠沉香精油揮發(fā)性成分分析

采用GC-MS方法對(duì)QEO揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，得到總離子流色譜圖（圖1）。結(jié)果如表1 所示，從QEO 中鑒定出37種成分，其主要的化合物類別為色酮類（50.08%）、倍半萜類（26.28%）、芳香族化合物（12.59%）（圖2）。通過(guò)峰面積歸一化法測(cè)定相對(duì)百分含量前5 位從高到低依次為2-（2-苯乙基）-色酮（50.08%）、石竹素（8.45%）、綠葉烷（6.46%）、欖香醇（3.88%）、2-烯丙基-6-甲基苯酚（2.78%）。其中，相對(duì)含量最高的成分為2-（2-苯乙基）-色酮，說(shuō)明其為QEO 的主要揮發(fā)性成分。此外，研究發(fā)現(xiàn)從白木香中分離出的2-（2-苯乙基）-色酮[12]及其衍生物[13]能夠顯著抑制LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞NO 的過(guò)量產(chǎn)生，表明其具有良好的抗炎活性。

2.2 奇楠沉香精油抗氧化活性的測(cè)定

本研究測(cè)試1～50 mg/mL 濃度范圍內(nèi)QEO 清除DPPH 自由基的能力。從圖3A 可以看出QEO對(duì)DPPH 自由基清除能力隨著QEO濃度增大逐漸增強(qiáng)，在濃度為1 mg/mL 時(shí)，QEO 清除率為51.98%。此外，可明顯看出QEO 清除DPPH 自由基的能力在20 mg/mL 時(shí)達(dá)到最大值，說(shuō)明QEO在1～50 mg/mL 范圍具有一定的清除DPPH 自由基的能力。如圖3B 所示，QEO 總抗氧化能力的結(jié)果以每毫升含有的Fe²⁺含量表示。FeSO 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=4.8772x+0.001，R²=0.9998，說(shuō)明線性良好，可用于抗氧化能力的計(jì)算。在1～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著QEO 濃度增大，F(xiàn)e²⁺含量逐漸增加，表示QEO 的還原力也逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明QEO的總抗氧化能力與濃度存在一定的量效關(guān)系。

2.3奇楠沉香精油生物信息學(xué)分析

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到QEO活性成分靶點(diǎn)有594 個(gè)，炎癥靶點(diǎn)15394個(gè)，QEO 與炎癥的交集靶點(diǎn)共有553個(gè)（圖4）。圖5A 為QEO 活性成分交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree值的大小，排名前15 的關(guān)鍵活性成分為紫蘇醇、欖香醇、α-古巴烯-11-醇、1，3-雙-（2-環(huán)丙基，2-甲基環(huán)丙基）-丁-2-烯-1-酮、異香橙烯環(huán)氧化物、石竹素、1b，5，5，6a-四甲基-八氫-1-氧雜環(huán)丙烷并[a]茚-6-酮、異香葉醇、順式-（Z）-α-雙沒(méi)藥烯環(huán)氧化物、纈草提取物、α-甜沒(méi)藥醇、氧雜環(huán)十四烷-4，11-二炔、除蟲(chóng)菊酯、2-（2-苯乙基）色酮、2-甲基-3-（苯磺?；┘谆?2-環(huán)戊烯-1-酮。從圖5A 中可看出QEO發(fā)揮抗炎活性時(shí)具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。如圖5B所示，QEO 發(fā)揮抗炎活性的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要包括SRC、MAPK1、AKT、HSP90AA1、PI3K3CA 等。在David 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)QEO作用炎癥的553 個(gè)交集靶蛋白進(jìn)行GO 注釋分析和KEGG 信號(hào)通路富集分析。如圖6A 所示，QEO發(fā)揮抗炎活性可能與細(xì)胞質(zhì)膜上的靶點(diǎn)、以及蛋白磷酸化和ATP 結(jié)合等作用環(huán)節(jié)有關(guān)。KEGG富集分析得到186 條信號(hào)通路，以P 值作為富集程度顯著性標(biāo)準(zhǔn)，取排名前20 條通路建立氣泡圖。如圖6B 所示，QEO作用炎癥反應(yīng)較顯著的通路主要有NF-κB、MAPK和PI3K-Akt 等炎癥信號(hào)通路，以上結(jié)果說(shuō)明QEO可能是通過(guò)上述信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。因此，本研究在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上重點(diǎn)考察QEO對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用。

2.4 奇楠沉香精油對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

如圖7 所示，將1、10、20、50 μg/mL QEO作用于RAW264.7 細(xì)胞24 h 后對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行檢測(cè)。與COG 相比，在QEO 濃度為50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率為43.24%，顯示出極顯著毒性。當(dāng)QEO 濃度在1～20 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞活力與COG 相比均無(wú)明顯差異。因此，選取1、10、20 μg/mL 濃度的QEO 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 奇楠沉香精油對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO含量的影響

根據(jù)說(shuō)明書(shū)，以NaNO作為標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制NO 標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.0082x?0.007，R²=0.9996，說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi)線性良好，可用于NO含量的計(jì)算。如圖8 所示，LPS 使對(duì)照組中的NO含量顯著升高到COG的5倍，說(shuō)明LPS能顯著刺激RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，而1、10、20 μg/mL QEO處理組能夠極顯著地抑制NO的過(guò)量產(chǎn)生（P<0.001），且呈濃度依賴性。

2.6奇楠沉香精油對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO熒光強(qiáng)度的影響

如圖9 所示，與空白組相比，LPS導(dǎo)致細(xì)胞中熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P<0.001），表示LPS刺激使得細(xì)胞中的NO含量顯著增加。而加入QEO的處理組，隨著QEO濃度的增加，其熒光強(qiáng)度逐漸減弱。說(shuō)明LPS能夠刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)，而QEO處理使得這種炎癥反應(yīng)有所緩解。

2.7奇楠沉香精油對(duì)RAW264.7細(xì)胞ROS水平的影響

在LPS誘導(dǎo)的炎癥過(guò)程中，細(xì)胞可能會(huì)受到刺激產(chǎn)生過(guò)量的ROS，導(dǎo)致ROS 和抗氧化劑之間的失衡，誘發(fā)免疫功能紊亂[14]。細(xì)胞中ROS 的熒光強(qiáng)度如圖10 所示，和COG 相比，LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生了大量的ROS。但經(jīng)過(guò)1、10、20 μg/mL QEO 處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量呈濃度依賴性極顯著降低（P<0.001），其中20 μg/mLQEO處理組的熒光水平與COG 基本一致。

2.8 奇楠沉香精油對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子的影響

RAW264.7細(xì)胞被激活時(shí)，炎癥因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）會(huì)過(guò)度釋放，這將使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重甚至失控，最終導(dǎo)致機(jī)體炎性病理?yè)p傷[15]。如圖11 所示，與COG相比，MOG 中的TNF-α、IL-6 和IL-1β 經(jīng)過(guò)LPS 刺激后，其含量均極顯著增加（P<0.001），而在1、10、20 μg/mL的QEO 預(yù)處理的試驗(yàn)組，TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量隨著QEO濃度的增加呈極顯著降低（P<0.001），說(shuō)明QEO 能夠劑量依賴性地抑制LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子的過(guò)度產(chǎn)生。結(jié)果表明QEO 可以顯著抑制由LPS 刺激導(dǎo)致的RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

2.9 奇楠沉香精油對(duì)RAW264.7細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響

為了進(jìn)一步研究QEO發(fā)揮抗炎活性的作用機(jī)制，通過(guò)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)行研究。如圖12 所示，當(dāng)RAW264.7 細(xì)胞被LPS刺激后，P-P65和P-IκB-α蛋白的表達(dá)極顯著增加（P<0.001）。然而，經(jīng)過(guò)QEO的預(yù)處理能極顯著下調(diào)細(xì)胞中P-P65 和P-IκB-α蛋白的表達(dá)（P<0.001），并且隨著QEO 的增加，其磷酸化蛋白的表達(dá)水平逐漸下降，說(shuō)明QEO 對(duì)于P65 和IκB-α 蛋白磷酸化的抑制具有顯著效果，能夠抑制NF-κB 通路的激活，進(jìn)而發(fā)揮良好的抗炎活性作用。

3 討論

目前有關(guān)沉香的研究不斷加深，沉香功效也得到了更多發(fā)掘和利用。QEO作為奇楠沉香最重要的活性成分，開(kāi)發(fā)價(jià)值巨大。本研究從QEO中共鑒定出37 種成分，其主要的化合物類別為色酮類、倍半萜類和芳香族化合物， 含量分別為50.08%、26.28%和12.59%。大量研究發(fā)現(xiàn)從沉香中分離出的色酮類[16]和倍半萜類[17]化合物具有較好的抗炎作用，能夠減輕炎癥損傷。此外，YANG 等[18]對(duì)野生和人工栽培的奇楠沉香進(jìn)行成分比較，發(fā)現(xiàn)其中的色酮類含量明顯不同，分別為72.43%和95.61%，本研究結(jié)果與此也有較大差異，這可能與奇楠沉香的種植地、結(jié)香方式不同有關(guān)。通過(guò)體外抗氧化活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，QEO在1～50 mg/mL濃度范圍的DPPH自由基清除率和總抗氧化能力隨著濃度的增加而上升，結(jié)果表明QEO 具有較好的抗氧化活性。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的抗氧化劑的有效成分均具有抗炎特性[19]，綜合以上分析表明QEO 在抗炎方面具有巨大的潛力。

本研究基于上述結(jié)果，采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)分析QEO的抗炎作用機(jī)制。篩選出QEO 與炎癥交集靶點(diǎn)553個(gè)，通過(guò)拓?fù)浞治龅玫降某煞?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖可以看出QEO中的核心成分類型為倍半萜類化合物和2-（2-苯乙基）色酮，這些結(jié)果提示QEO具有多組分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。GO 和KEGG 富集分析結(jié)果表明QEO主要通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、樹(shù)突等細(xì)胞組分參與基因表達(dá)的調(diào)控，主要涉及蛋白磷酸化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)等生物過(guò)程， 且發(fā)揮抗炎活性與NF-κB、MAPK、PI3K-Akt 等信號(hào)通路有關(guān)。其中，NF-κB 是一條經(jīng)典的與炎癥密切相關(guān)的信號(hào)通路。在炎癥過(guò)程中，NF-κB 通路能夠激活iNOS，iNOS是一種重要的功能酶，可以促使細(xì)胞分泌大量的NO[20]。為了進(jìn)一步明確QEO在發(fā)揮抗炎活性過(guò)程中與NF-κB 信號(hào)通路的相關(guān)性，研究使用RAW264.7 細(xì)胞的炎癥模型進(jìn)行驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)QEO在1～20 μg/mL 濃度范圍對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞NO 具有極顯著的抑制作用。為了驗(yàn)證上述結(jié)果，本研究對(duì)NO 熒光水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)QEO 在20 μg/mL 時(shí)能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)的NO水平，表現(xiàn)出良好的抗炎活性。

此外，研究表明ROS會(huì)在細(xì)胞受到刺激后大量產(chǎn)生并激活NF-κB 信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[21]。為了進(jìn)一步深入探究QEO的抗炎活性，本研究對(duì)RAW264.7 細(xì)胞中的ROS水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)QEO處理顯著抑制了細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，減少了ROS 的表達(dá)量。NO水平的升高可以促使RAW264.7細(xì)胞分泌促炎因子TNF-α，而TNF-α 又可以調(diào)節(jié)IL-6 和IL-1β 細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞損傷級(jí)聯(lián)效應(yīng)放大，加重炎癥損傷[22]。因此，抑制炎癥因子的過(guò)度釋放是一種有效的抗炎方式。本研究發(fā)現(xiàn)QEO能夠顯著降低TNF-α、IL-6和IL-1β 等炎癥因子的含量，且呈濃度依賴性。此前高小力等[23]的研究表明白木香精油能夠顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞模型中炎癥細(xì)胞因子IL-1β 和IL-6 的產(chǎn)生和釋放，這與本研究中的QEO 發(fā)揮抗炎效果的方式一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)QEO 能夠下調(diào)P65 和IκB-α蛋白的磷酸化水平，表示QEO具有使P65 和IκB-α的活化受到抑制的作用，說(shuō)明QEO 能夠通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活，從而表現(xiàn)出良好的抗炎活性作用。

4結(jié)論

綜上所述，QEO 的揮發(fā)性成分有2-（2-苯乙基）色酮、石竹素、綠葉烷、欖香醇、2-烯丙基-6-甲基苯酚等，且具有一定的抗氧化能力。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)QEO 與炎癥共有553 個(gè)交集靶點(diǎn)，且QEO發(fā)揮抗炎活性與MAPK、NF-κB、PI3K-Akt 等信號(hào)通路有關(guān)。此外，本研究揭示了QEO 能夠顯著抑制由LPS 誘導(dǎo)的過(guò)量ROS 的產(chǎn)生，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制NO、TNF-α、IL-6 和IL-1β 的大量產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎活性的作用機(jī)制。本研究通過(guò)揮發(fā)性成分分析和分子細(xì)胞生物學(xué)的方法對(duì)QEO 的抗炎活性進(jìn)行了闡釋，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和高效利用奇楠沉香資源提供理論基礎(chǔ)。