革蘭氏陰性菌中β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

徐超奕，張婷，蔡靜曉，余志良，裘娟萍，音建華

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音建華 博士，浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院副教授，碩士生導(dǎo)師。2013年于浙江大學(xué)微生物學(xué)專業(yè)獲博士學(xué)位；2013–2015年在浙江大學(xué)從事博士后研究。主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制及細(xì)胞壁合成調(diào)控機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)了一條獨(dú)特的β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)通路，在和等國(guó)際主流期刊以第一作者發(fā)表研究論文7篇，主持國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目，擔(dān)任浙江省微生物學(xué)會(huì)專業(yè)委員會(huì)青年委員。

革蘭氏陰性菌中β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

徐超奕，張婷，蔡靜曉，余志良，裘娟萍，音建華

浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014

徐超奕, 張婷, 蔡靜曉, 等. 革蘭氏陰性菌中β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展.生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(8): 1288–1296.Xu CY, Zhang T, Cai JX, et al. Progress in regulatory mechanism for inducing β-lactamase in Gram-negative bacteria. Chin J Biotech, 2018, 34(8): 1288–1296.

β-內(nèi)酰胺類抗生素是應(yīng)用最廣的一類抗菌藥物。β-內(nèi)酰胺酶能將β-內(nèi)酰胺類抗生素水解，其誘導(dǎo)表達(dá)是革蘭氏陰性菌對(duì)該類抗生素產(chǎn)生耐藥性的最主要原因。文中重點(diǎn)綜述了革蘭氏陰性菌中β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)的兩種調(diào)控機(jī)制。在經(jīng)典的-調(diào)控系統(tǒng)中，β-內(nèi)酰胺酶的誘導(dǎo)表達(dá)與肽聚糖循環(huán)密切相關(guān)，并且LysR型轉(zhuǎn)錄因子AmpR發(fā)揮核心的調(diào)控作用。近年來發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺類抗生素能激活雙組分系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)。最后，討論了革蘭氏陰性菌中β-內(nèi)酰胺類耐藥今后的研究方向。

革蘭氏陰性菌，β-內(nèi)酰胺類抗生素，β-內(nèi)酰胺酶，調(diào)控機(jī)制，雙組分系統(tǒng)

β-內(nèi)酰胺類抗生素 (簡(jiǎn)稱β-內(nèi)酰胺類，β-lactams) 是臨床治療中應(yīng)用最悠久且最廣泛的一類抗菌藥物。該類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中都含有β-內(nèi)酰胺環(huán)，包括青霉素類、頭孢菌素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑等[1]。青霉素結(jié)合蛋白 (Penicillin binding protein，PBP) 是細(xì)菌中重要的肽聚糖合成酶，負(fù)責(zé)肽聚糖糖鏈的聚合和鏈間的交聯(lián)。β-內(nèi)酰胺類能與青霉素結(jié)合蛋白不可逆共價(jià)結(jié)合，從而阻斷肽聚糖的生物合成過程，致使細(xì)菌裂解死亡[2]。

近年來，由于抗生素的濫用和不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性問題日益凸顯。世界衛(wèi)生組織公布了一份亟待研發(fā)新抗生素的12種耐藥細(xì)菌清單，其中半數(shù)為β-內(nèi)酰胺類耐藥細(xì)菌，尤其是優(yōu)先度最高的3種細(xì)菌均為耐碳青霉烯類的革蘭氏陰性桿菌[3]。細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類產(chǎn)生耐藥的原因包括：一是修飾或改變抗生素的靶點(diǎn)，革蘭氏陽(yáng)性菌多采用該機(jī)制產(chǎn)生耐藥性，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin resistant，MRSA) 對(duì)β-內(nèi)酰胺類的抗性即來源于此；二是編碼β-內(nèi)酰胺酶將抗生素水解，這是革蘭氏陰性菌中最為普遍的耐藥機(jī)制；三是減弱細(xì)胞外膜通透性，限制抗生素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；四是提高藥物外排泵的表達(dá)，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗生素外排[4]。

β-內(nèi)酰胺酶廣泛存在于各種臨床致病菌和環(huán)境微生物中，根據(jù)氨基酸序列一致性可分為A、B、C和D四種類型[5]。其中，A、C和D型均為絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶，而B型為金屬β-內(nèi)酰胺酶。β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)受β-內(nèi)酰胺類誘導(dǎo)，但由于該類抗生素?zé)o法穿越細(xì)胞質(zhì)膜，其如何誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)長(zhǎng)期以來備受關(guān)注。目前研究最為深入的是部分革蘭氏陰性桿菌中C 型β-內(nèi)酰胺酶AmpC誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)其與肽聚糖循環(huán)和LysR型轉(zhuǎn)錄因子AmpR密切相關(guān)。近年來，越來越多的研究表明雙組分系統(tǒng) (Two component system，TCS) 也能調(diào)控β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)。本文將結(jié)合實(shí)驗(yàn)室研究工作，綜述這兩種β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以期為新型抗生素的研發(fā)提供新靶點(diǎn)和新思路。

1 經(jīng)典的ampR-ampC調(diào)控系統(tǒng)

C型β-內(nèi)酰胺酶AmpC (由基因編碼) 是一種頭孢菌素酶，能夠水解青霉素類、頭孢菌素類以及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類等抗生素[6-7]。AmpC的誘導(dǎo)表達(dá)是腸桿菌科細(xì)菌 (如陰溝腸桿菌和弗氏檸檬酸桿菌) 以及非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌 (如銅綠假單胞菌) 對(duì)β-內(nèi)酰胺類產(chǎn)生耐藥性的主要原因。對(duì)這些細(xì)菌的研究表明，AmpC的誘導(dǎo)表達(dá)與肽聚糖循環(huán)密切相關(guān)，并且LysR型轉(zhuǎn)錄因子AmpR (由基因編碼) 起核心調(diào)控作用，這種機(jī)制被稱為經(jīng)典的-調(diào)控系統(tǒng)[8-10]。

1.1 ampR-ampC divergon

在含有-調(diào)控系統(tǒng)的細(xì)菌中，與基因在染色體上相鄰排列，啟動(dòng)子區(qū)域相互重疊，但轉(zhuǎn)錄方向相反，即形成divergon結(jié)構(gòu)。基因編碼LysR型調(diào)控蛋白AmpR，是基因的轉(zhuǎn)錄激活因子。AmpR通常具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：效應(yīng)物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。效應(yīng)物結(jié)合結(jié)構(gòu)域能與不同的效應(yīng)物或配體結(jié)合，從而改變DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，通過與和基因間隔區(qū)序列結(jié)合，調(diào)控兩個(gè)基因的表達(dá)[11]。

1.2 肽聚糖循環(huán)過程

細(xì)菌在正常生長(zhǎng)過程中，肽聚糖始終處于一種動(dòng)態(tài)平衡。在幾十種肽聚糖合成酶和水解酶的共同作用下，不斷地進(jìn)行更新和循環(huán)[12]。由于β-內(nèi)酰胺類的靶點(diǎn)是青霉素結(jié)合蛋白，抗生素處理時(shí)將不可避免地破壞肽聚糖循環(huán)的平衡。與β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)密切相關(guān)的肽聚糖循環(huán)酶系主要包括AmpG、AmpD和NagZ[12]。AmpG是位于細(xì)胞質(zhì)膜上的一種通透酶，含有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)肽聚糖水解產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)，如GlcNAc-anhMurNAc和GlcNAc-anhMurNAc-peptides等[13-14]。AmpD和NagZ均位于細(xì)胞質(zhì)中，其中AmpD為N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶 (N-acetylmuramyl-L-Ala amidase)，能迅速水解anhMurNAc和L-Ala之間的酰胺鍵；而NagZ是β-乙酰氨基葡糖糖苷酶 (β-N-acetylglucosaminidase)，負(fù)責(zé)切開GlcNAc和anhMurNAc之間的β-1,4糖苷鍵[15]。AmpD和NagZ的共同作用可將細(xì)胞質(zhì)中的肽聚糖水解產(chǎn)物進(jìn)一步生成GlcNAc、anhMurNAc以及anhMurNAc-peptides (圖1)。

1.3 AmpG-AmpD-NagZ-AmpR調(diào)控通路

在缺乏β-內(nèi)酰胺類誘導(dǎo)物時(shí)，由于AmpD和NagZ的作用使細(xì)胞內(nèi)anhMurNac-peptides始終維持在較低的濃度，而三肽L-Ala-D-Glu--Dap含量較高，進(jìn)一步催化后生成UDP-MurNAc- pentapeptide。UDP-MurNAc-pentapeptide可作為阻遏信號(hào)分子與AmpR結(jié)合，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，細(xì)胞周質(zhì)空間中肽聚糖的損傷導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的肽聚糖水解產(chǎn)物大幅度增加，AmpD達(dá)到飽和狀態(tài)，anhMurNAc-peptides大量積累，并作為誘導(dǎo)信號(hào)分子與UDP-MurNAc- pentapeptide競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合AmpR，引起AmpR蛋白構(gòu)象的變化，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄 (圖1)[11]。

AmpG-AmpD-NagZ-AmpR調(diào)控通路中任一基因的突變都有可能影響基因的誘導(dǎo)表達(dá)。基因的缺失阻斷了anhMurNac-peptides的水解，使得誘導(dǎo)信號(hào)分子始終處于高濃度，引起AmpC高表達(dá)，致使很多臨床菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類產(chǎn)生耐藥性[16-17]。中共有3個(gè)AmpD同源蛋白，它們的依次失活能引起AmpC表達(dá)水平和細(xì)菌耐藥程度逐級(jí)增加[18-20]。AmpG的失活使誘導(dǎo)信號(hào)分子前體無法進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致基因的表達(dá)不再被誘導(dǎo)[21-22]。NagZ可催化誘導(dǎo)信號(hào)分子的產(chǎn)生，因此基因突變與效果一致，均能阻斷基因的表達(dá)。AmpG和NagZ的失活還能顯著降低因基因突變引起的AmpC高表達(dá)[23]。

圖1 AmpR介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控模式圖

這種經(jīng)典的-調(diào)控系統(tǒng)同樣適用于目前所研究的其他類型β-內(nèi)酰胺酶的誘導(dǎo)表達(dá)，如霍亂弧菌中B型β-內(nèi)酰胺酶VanG[24]、野油菜黃單胞菌中A型β-內(nèi)酰胺酶Blaxc[25-26]以及嗜麥芽窄食單胞菌中A型β-內(nèi)酰胺酶L2 (BlaL2) 和B型β-內(nèi)酰胺酶L1 (BlaL1)[27-29]。中基因和基因構(gòu)成divergon，但AmpR可同時(shí)激活L1/L2的表達(dá)。此外，該菌中基因 (編碼PBP1a) 的失活致使這兩個(gè)β-內(nèi)酰胺酶呈組成型高表達(dá)，并且該過程依賴于AmpG-AmpD-AmpR，但不依賴于NagZ，表明L1/L2的表達(dá)除了遵循經(jīng)典的-調(diào)控系統(tǒng)外，還存在一條不依賴于NagZ的調(diào)控通路[30-33]。

1.4 肽聚糖水解酶對(duì)β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的影響

正是由于肽聚糖循環(huán)與AmpC表達(dá)密切相關(guān)，細(xì)胞周質(zhì)空間中肽聚糖的細(xì)微變化都有可能影響β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)部分肽聚糖水解酶與β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，如溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶 (Lytic transglycosylases，LTs) 和低分子量PBP等。通常，這些肽聚糖水解酶在細(xì)菌中數(shù)量較多，并且功能冗余，它們對(duì)β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的影響在不同細(xì)菌中存在差異。LTs能將GlcNAc和MurNAc之間的β-1,4糖苷鍵切開，釋放-調(diào)控系統(tǒng)中的誘導(dǎo)信號(hào)分子前體GlcNAc-1,6-anhMurNAc peptides。因此，LTs的失活勢(shì)必影響β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)。中含有11個(gè)LTs，但只有SltB1和MltB的失活增強(qiáng)AmpC的表達(dá)，而SltB的失活降低AmpC的表達(dá)[34-35]。中含有6個(gè)LTs，MltD1的失活通過上調(diào)其他LTs (MltB1和MltD2) 的表達(dá)增強(qiáng)L1/L2本底水平的表達(dá)，該過程依賴于AmpG-AmpD-NagZ-AmpR通路以及雙組分系統(tǒng)CreBC[36]。低分子量PBP具有DD-羧肽酶和/或內(nèi)肽酶活性，負(fù)責(zé)肽聚糖的修飾。中PBP4的突變使β-內(nèi)酰胺酶AmpC以依賴于AmpR的方式過表達(dá)，顯著增強(qiáng)對(duì)β-內(nèi)酰胺類的耐藥性[37-38]。

2 雙組分系統(tǒng)介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)

雙組分系統(tǒng)是微生物中廣泛存在的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。該系統(tǒng)高度保守，一般由組氨酸激酶 (Histidine kinase) 和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白 (Response regulator) 二元組分構(gòu)成。組氨酸激酶屬跨膜蛋白，其N末端能夠感知外界信號(hào)，催化C末端保守的組氨酸殘基自磷酸化；然后將磷酰基轉(zhuǎn)移至位于細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，保守的天冬氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而激活或抑制基因的表達(dá)，使微生物適應(yīng)不同的環(huán)境變化[39]。組氨酸激酶感知的信號(hào)多種多樣，如滲透壓、細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞壁損傷、金屬離子和抗生素等；反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控的生命過程也多種多樣，如維持穩(wěn)態(tài)、毒力響應(yīng)、呼吸轉(zhuǎn)換以及抗生素耐藥等。

2.1 氣單胞菌中β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的調(diào)控

氣單胞菌屬中的BlrAB是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)直接調(diào)控β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的雙組分系統(tǒng)。屬細(xì)菌通常編碼三種可誘導(dǎo)型β-內(nèi)酰胺酶：B型CphA (也稱Imi)、C型Cep和D型Amp[40-41]。對(duì)模式菌株嗜水氣單胞菌的研究發(fā)現(xiàn)，編碼雙組分系統(tǒng)的基因位于β-內(nèi)酰胺酶基因的上游，其中編碼反應(yīng)調(diào)控蛋白BlrA，而編碼組氨酸激酶BlrB。β-內(nèi)酰胺類誘導(dǎo)物抑制PBP的活性，致使肽聚糖平衡紊亂，二糖五肽單元 (GlcNAc-MurNAc-pentapeptide) 含量增加，很有可能作為信號(hào)分子通過直接或間接作用使BlrB自磷酸化；隨后，磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至BlrA，激活的BlrA與特異的識(shí)別標(biāo)簽(cre/blr-tag：TTCACnnnnnnTTCAC) 結(jié)合，從而募集RNA聚合酶啟動(dòng)β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)[42](圖2)。三個(gè)β-內(nèi)酰胺酶基因的上游均存在該特異標(biāo)簽，并且標(biāo)簽的重復(fù)次數(shù)與β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)水平呈正相關(guān)。、和基因前的標(biāo)簽數(shù)分別為1、2、3個(gè)，β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)水平為ImiH>CepH>AmpH[41,43-44]。BlrB感知的信號(hào)源自于肽聚糖損傷，DD-羧肽酶/內(nèi)肽酶 (PBP4和BlrY) 的失活顯著提高二糖五肽單元含量，增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá) (圖2)；而萬古霉素能與D-Ala-D-Ala特異性結(jié)合，處理細(xì)菌后β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)受到抑制。另外，基因下游含有一個(gè)編碼內(nèi)膜蛋白的基因，其轉(zhuǎn)錄受BlrAB控制，但BlrD在β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)中的作用尚不清楚[44]。

圖2 雙組分系統(tǒng)介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)調(diào)控示意圖

大腸桿菌中的雙組分系統(tǒng)CreBC與BlrAB高度同源，最初發(fā)現(xiàn)CreBC是中間代謝的全局調(diào)控因子[43,45]。反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CreB識(shí)別的特異序列與BlrA一致，當(dāng)屬來源的3個(gè)β-內(nèi)酰胺酶基因連同上游序列一起轉(zhuǎn)入DH5α菌株 (CreB+) 時(shí)，β-內(nèi)酰胺酶可被成功表達(dá)[43]。

和中的CreBC可能參與β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的調(diào)控。中PBP4的突變特異性激活CreBC，然后上調(diào)CreD (與BlrD同源) 的表達(dá)，間接參與β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)[37,46]。此外，CreBC還在β-內(nèi)酰胺類脅迫、生物膜形成以及細(xì)菌適應(yīng)度方面發(fā)揮重要的作用[46]。中CreBC與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性密切相關(guān)[47]，MltD1失活導(dǎo)致的β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)同時(shí)需要CreBC和AmpR的參與[36]。

2.2 弧菌中β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的調(diào)控

副溶血性弧菌是一種重要的食源性致病菌，其對(duì)青霉素類的耐藥性主要由A型β-內(nèi)酰胺酶 (V100) 介導(dǎo)[48]。該菌中含有32個(gè)可能的雙組分系統(tǒng)，但只有VbrKR缺失后顯著降低β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)和β-內(nèi)酰胺類耐藥性。VbrK是一種能直接感知β-內(nèi)酰胺類的組氨酸激酶，抗生素的結(jié)合使其空間構(gòu)象發(fā)生變化，組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域與ATP酶結(jié)構(gòu)域之間更加接近，隨后VbrK自磷酸化并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白VbrR，從而觸發(fā)β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)[49](圖2)。有趣的是，VbrKR還能調(diào)控PBP1a和PBP3的表達(dá)，但是否與β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)相關(guān)尚不清楚。

與BlrAB/CreBC明顯不同的是，VbrK感知的信號(hào)并非來自于肽聚糖的損傷，而是直接與抗生素結(jié)合，然后迅速將信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，通過誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)保證在細(xì)胞裂解之前將抗生素水解[50]。VbrK是目前革蘭氏陰性菌中唯一發(fā)現(xiàn)能直接感知β-內(nèi)酰胺類的受體蛋白。幾乎所有弧菌屬細(xì)菌都編碼與VbrK同源的組氨酸激酶，因此弧菌屬可能普遍存在VbrK介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)調(diào)控機(jī)制。革蘭氏陽(yáng)性菌中β-內(nèi)酰胺酶 (如BlaP和BlaZ) 的誘導(dǎo)表達(dá)也起始于抗生素與膜受體蛋白之間的直接相互作用，但受體蛋白感知抗生素后自身變成有活性的金屬蛋白酶，通過水解阻遏蛋白誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)[51]。

2.3 希瓦氏菌中β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的調(diào)控

水環(huán)境中廣泛存在的希瓦氏菌屬被認(rèn)為是β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類耐藥基因的天然存儲(chǔ)庫(kù)，部分菌株也逐漸成為新興致病菌[52-53]。該屬的模式菌株奧奈達(dá)希瓦氏菌編碼7個(gè)假定的β-內(nèi)酰胺酶，其中由染色體介導(dǎo)的D型β-內(nèi)酰胺酶BlaA (也稱為OXA-54) 可能是碳青霉烯類水解酶Oxacillinase的祖先[54]。筆者近年來的研究發(fā)現(xiàn)，該酶的表達(dá)受氨芐青霉素誘導(dǎo)，但具體的誘導(dǎo)機(jī)制與AmpR介導(dǎo)的調(diào)控系統(tǒng)差異顯著，主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是基因組中基因未與其他調(diào)控蛋白基因構(gòu)成divergon，也不含有與AmpR高度同源的調(diào)控蛋白；二是主要的肽聚糖循環(huán)酶 (如AmpG、NagZ和AmpD) 對(duì)表達(dá)的影響與經(jīng)典的-調(diào)控系統(tǒng)相反[55-57]。和基因缺失后基因的表達(dá)仍可被誘導(dǎo)，表明該菌中存在一條不依賴于AmpG-NagZ-AmpR的β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)通路。該通路與PBP1a及其外膜脂蛋白輔因子LpoA有關(guān)，這兩個(gè)蛋白形成肽聚糖合成酶復(fù)合體PBP1a-LpoA，其失活導(dǎo)致基因呈組成型高表達(dá)，暗示誘導(dǎo)表達(dá)的信號(hào)分子位于周質(zhì)空間。中含有數(shù)目眾多的雙組分系統(tǒng)，雖不與CreBC或VbrKR高度同源，但有證據(jù)表明其他雙組分系統(tǒng)參與表達(dá)的調(diào)控。PBP1a與周質(zhì)空間中的β-內(nèi)酰胺類共價(jià)結(jié)合而失活，致使細(xì)胞被膜受損，激活雙組分系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)[58-60]。

3 結(jié)論與展望

由此可見，革蘭氏陰性菌中β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有以下共同特點(diǎn)：LysR型轉(zhuǎn)錄因子或雙組分系統(tǒng)在調(diào)控中起核心作用；如果β-內(nèi)酰胺酶基因與LysR型轉(zhuǎn)錄因子編碼基因組成divergon，那么該β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)受LysR型轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控；同一物種中可能同時(shí)包含兩種調(diào)控通路 (如和)，二者之間存在相互影響；肽聚糖循環(huán)在β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)過程中發(fā)揮重要的作用，除VbrKR直接感知抗生素外，其他已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的調(diào)控蛋白均感知肽聚糖水解片段。

由于肽聚糖生物合成和循環(huán)過程非常復(fù)雜，目前我們對(duì)誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)的信號(hào)分子仍不清晰，尤其是抗生素作用對(duì)肽聚糖的具體影響缺乏詳實(shí)數(shù)據(jù)。未來的研究應(yīng)該從以下幾個(gè)方面展開：1) 繼續(xù)研究不同細(xì)菌中β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，尤其是重要的臨床致病菌和環(huán)境微生物。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展使得這些細(xì)菌的遺傳改造變得方便快捷。2) 利用生物信息學(xué)工具，從數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控相關(guān)元件的分布規(guī)律，在進(jìn)化層面上明確抗性基因的來源和轉(zhuǎn)移規(guī)律。3) 已有報(bào)道表明NagZ抑制劑能有效降低AmpC高產(chǎn)菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類的耐藥性[23]，接下來應(yīng)針對(duì)β-內(nèi)酰胺酶誘導(dǎo)表達(dá)通路中的新靶點(diǎn)，加大篩選特異性藥物的力度，從而有效解決革蘭氏陰性菌中的β-內(nèi)酰胺類耐藥問題。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Progress in regulatory mechanism for inducing β-lactamase in Gram-negative bacteria

Chaoyi Xu, Ting Zhang, Jingxiao Cai, Zhiliang Yu, Juanping Qiu, and Jianhua Yin

College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, Zhejiang, China

Beta-lactams are the most widely used antibiotics. One of the principle mechanisms for Gram-negative bacteria to resist β-lactams is by producing β-lactamases that degrade β-lactams. This review highlights two regulatory mechanisms for inducing β-lactamase in Gram-negative bacteria. In the-paradigm, the induction of β-lactamase is intimately linked to peptidoglycan recycling. AmpR, a LysR-type transcriptional regulator, plays a central role in regulating expression of β-lactamase. Recent studies found that two-componentsignal transduction pathway is activated by β-lactams, which in turn induces the expression of β-lactamase. Finally, we discussed the future research directions in β-lactam resistance in Gram-negative bacteria.

Gram-negative bacteria, β-lactam antibiotics, β-lactamase, regulatory mechanism, two-component system

May 4, 2018;

June 11, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31600041).

Jianhua Yin. Tel/Fax: +86-571-88320057; E-mail: jianhuay@zjut.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31600041) 資助。

2018-07-02

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180629.1800.001.html

10.13345/j.cjb.180187