新型抗結(jié)核藥物研發(fā)：微生物非常規(guī)培養(yǎng)與沉默基因激活策略

滕鐵山，謝龍祥，謝建平

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謝建平 西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所副所長，博導(dǎo)，研究員 (二級(jí))，中國微生物學(xué)理事/基礎(chǔ)微生物/分子微生物與生物工程專委會(huì)副主任、中國微生物學(xué)會(huì)教學(xué)工作委員會(huì)委員、中國遺傳學(xué)會(huì)微生物遺傳專委會(huì)委員、中國醫(yī)促會(huì)結(jié)核病防治分會(huì)結(jié)核病基礎(chǔ)組副主任、中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病分會(huì)基礎(chǔ)專委會(huì)委員、重慶微生物學(xué)會(huì)副理事長、重慶免疫學(xué)會(huì)副理事長，中國毒理學(xué)會(huì)毒素毒理專委會(huì)理事、《遺傳》副主編、《生物工程學(xué)報(bào)》、《藥學(xué)學(xué)報(bào)》、《微生物學(xué)報(bào)》、《中國抗生素雜志》和編委，享受國務(wù)院政府特殊津貼專家 (2010)，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃入選者 (2011)，重慶市縉云英才入選者。主要圍繞結(jié)核病持續(xù)開展研究，先后主持或者主研國家傳染病科技重大專項(xiàng)、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金等20余項(xiàng)，近5年以通訊作者發(fā)表SCI論文80余篇。主譯/副主編《圖解微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》、《結(jié)核病免疫學(xué)》、《分枝桿菌分子生物學(xué)》、《微生物學(xué)》、《藥學(xué)細(xì)胞生物學(xué)》和《DNA科學(xué)導(dǎo)論》等教材10余部。《生活中的DNA科學(xué)》獲教育部精品視頻課程 (2014) 和重慶市教學(xué)技術(shù)成果二等獎(jiǎng) (2016)?！敖Y(jié)核病防控新措施的基礎(chǔ)研究”獲重慶市自然科學(xué)三等獎(jiǎng) (2015)。

新型抗結(jié)核藥物研發(fā)：微生物非常規(guī)培養(yǎng)與沉默基因激活策略

滕鐵山1,2，謝龍祥1,2，謝建平2

1 河南大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物信息學(xué)研究所，河南 開封 475004 2 西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，重慶 400715

滕鐵山, 謝龍祥, 謝建平. 新型抗結(jié)核藥物研發(fā)：微生物非常規(guī)培養(yǎng)與沉默基因激活策略.生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(8): 1306–1315.Teng TS, Xie LX, Xie JP. Development of new anti-tuberculosis drugs: the strategy of unconventional microbial culture and silencing gene activation. Chin J Biotech, 2018, 34(8): 1306–1315.

由結(jié)核分枝桿菌感染引起的結(jié)核病是人類重要傳染病之一。臨床上結(jié)核菌耐藥性日趨嚴(yán)重，不斷出現(xiàn)的耐多藥及廣泛耐藥結(jié)核病患者，使現(xiàn)有的一線至五線藥物不能滿足結(jié)核病防控需求。微生物來源的天然產(chǎn)物是藥物先導(dǎo)化合物的重要來源。環(huán)境中存在大量常規(guī)培養(yǎng)條件下未培養(yǎng)微生物，同時(shí)微生物基因組中也存在大量未被表達(dá)的“沉默代謝途徑”。運(yùn)用各種方法對(duì)未培養(yǎng)微生物進(jìn)行再培養(yǎng)，同時(shí)激活微生物的沉默代謝途徑，進(jìn)而獲得潛在的新型抗生素藥物已成為目前研究熱點(diǎn)。文中系統(tǒng)闡述了近年來獲取天然化合物所采用的微生物非常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)及沉默代謝途徑激活策略，同時(shí)總結(jié)了利用這兩種方法獲得的新型抗結(jié)核天然產(chǎn)物，并展望了這些方法在抗結(jié)核藥物進(jìn)一步研發(fā)中的應(yīng)用前景。

結(jié)核分枝桿菌，未培養(yǎng)微生物，沉默基因，單株菌-多次級(jí)代謝產(chǎn)物 (OSMAC)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌 (，以下簡(jiǎn)稱結(jié)核菌) 感染引起的、嚴(yán)重危害人類健康的重要傳染病[1-2]。耐多藥結(jié)核病 (Multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB) 的出現(xiàn)使一線抗結(jié)核藥物不能有效達(dá)到治療目的，此時(shí)須使用二線以上抗結(jié)核藥物進(jìn)行治療。二線抗結(jié)核藥物治療周期平均在2–4年，且不如一線藥物治療效果好，常伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者的依從性差、復(fù)發(fā)率高，還可能導(dǎo)致廣泛耐藥結(jié)核病 (Extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB) 的出現(xiàn)[3]。最近又發(fā)現(xiàn)了全耐藥結(jié)核菌 (Totally drug-resistant tuberculosis，TDR-TB)，TDR-TB定義為結(jié)核菌在體外對(duì)所有的一線和二線抗結(jié)核藥物都有抗性，這更使得結(jié)核病的防治雪上加霜[4]。為了應(yīng)對(duì)這種狀況，美國和歐洲藥品管理局分別在2012年和2013年推出了兩種新型抗結(jié)核藥物貝塔喹啉(Bedaquiline，又稱TMC207) 和迪拉馬尼片(Delamanid，又稱OPC67683)，二者被專一用作耐藥結(jié)核的治療[5-6]。但即便如此，臨床上已經(jīng)分離到這兩種抗結(jié)核藥物的耐藥菌株。結(jié)核病的防控需要發(fā)展與現(xiàn)存藥物沒有交叉抗性的新型藥物[7-8]。

微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物是藥物先導(dǎo)化合物的重要來源，目前臨床上使用的60%的抗癌藥物和70%的抗生素是來源于天然產(chǎn)物及其衍生物[9]。面對(duì)病原菌耐藥嚴(yán)重的問題，重新發(fā)掘具有獨(dú)特作用機(jī)制的天然藥物顯得勢(shì)在必行。然而由于對(duì)微生物原位生長的環(huán)境條件及培養(yǎng)基質(zhì)方法的缺乏，超過99%的微生物不能通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得，而這些微生物中蘊(yùn)含著巨大的生物資源[10]。所以，增強(qiáng)微生物的可培養(yǎng)性、把更多的未培養(yǎng)微生物轉(zhuǎn)變成為可培養(yǎng)微生物將是一件意義重大的工作。其次，在微生物的合成途徑中存在大量在傳統(tǒng)單一培養(yǎng)條件下不表達(dá)的代謝途徑，稱為“沉默代謝途徑”。沉默代謝途徑具有合成新型次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過已發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物數(shù)量。在后基因組時(shí)代的今天，如何激活這些“沉默代謝途徑”，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類型更加多樣的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，挖掘和開發(fā)潛在的藥用資源，成為研究的熱點(diǎn)[11]。本文系統(tǒng)闡述了未培養(yǎng)微生物的非常規(guī)培養(yǎng)與沉默代謝途徑激活的方法，總結(jié)了利用這些方法獲得的新型抗結(jié)核天然產(chǎn)物，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的研究進(jìn)展，展望了這些方法在抗結(jié)核藥物研究中的應(yīng)用前景。

1 微生物來源天然產(chǎn)物的研究方法

通過改變培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和添加酶抑制劑等干擾因素，對(duì)未培養(yǎng)微生物進(jìn)行再培養(yǎng)，或激活某些微生物的合成基因簇，挖掘其產(chǎn)生特殊次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力，可以獲得大量骨架新穎、活性高的藥物前導(dǎo)化合物[9-12]。在抗結(jié)核藥物研究中，利用這些方法在土壤和海洋微生物中已經(jīng)獲得了豐富多樣的抗結(jié)核活性天然產(chǎn)物 (圖1)。下述為近年來常用的微生物非常規(guī)培養(yǎng)方法及沉默代謝途徑的激活策略。

1.1 未培養(yǎng)微生物的非常規(guī)培養(yǎng)

使用傳統(tǒng)微生物學(xué)培養(yǎng)技術(shù)對(duì)不同生境微生物可培養(yǎng)性的測(cè)定來看，海水中微生物可培養(yǎng)的約為0.001%–0.1%，淡水約為0.25%，土壤約為0.3%，活性污泥為1%–15%左右。由于未培養(yǎng)微生物無論是其物種類群還是新陳代謝途徑、生理生化反應(yīng)與產(chǎn)物等，都存在著豐富的新穎性和多樣性，因而比以往的可培養(yǎng)微生物具有更為豐富和多樣化的、可供人類開發(fā)利用的生物資源[13]。如利用原位培養(yǎng)方法，在微生物肯塔基倫茨氏菌中得到的化合物L(fēng)assomycin，其對(duì)結(jié)核菌具有特異的殺菌活性，并具有特殊的活性機(jī)制與殺菌效果。繼續(xù)探索未培養(yǎng)微生物的再培養(yǎng)，對(duì)抗結(jié)核藥物研發(fā)具有重要意義。增強(qiáng)微生物的可培養(yǎng)性的方法包括以下幾個(gè)方面：

(1) 限制性培養(yǎng)策略：傳統(tǒng)培養(yǎng)基的營養(yǎng)比較豐富，培養(yǎng)條件相對(duì)溫和，所以適合優(yōu)勢(shì)菌種較快生長。但地球上也同時(shí)分布著大量適應(yīng)貧瘠營養(yǎng)環(huán)境的微生物，較豐富的營養(yǎng)基質(zhì)特別是高濃度的鹽及有機(jī)物會(huì)造成它們復(fù)蘇障礙[14]。所以需要按培養(yǎng)目的進(jìn)行條件限制性培養(yǎng)(如厭氧、高溫、高鹽、寡營養(yǎng)、特殊的培養(yǎng)底物等)，才能分離出未培養(yǎng)微生物[15-16]。

圖1 微生物來源天然產(chǎn)物的研究方法 (其中未培養(yǎng)微生物的方法與OSMAC的策略在某些研究中是可以通用的)

(2) 添加信號(hào)分子：在培養(yǎng)基中加入微生物相互作用的信號(hào)分子，可簡(jiǎn)單模擬微生物間的相互作用，進(jìn)而滿足微生物生長繁殖的要求。經(jīng)常向培養(yǎng)基中加入酰基高絲氨酸內(nèi)酯、cAMP (Cyclic adenosine monophosphate，cAMP) 或ATP (Adenosine triphosphate，ATP) 等微生物之間溝通的信號(hào)分子，能促使未培養(yǎng)微生物得到培養(yǎng)。其中與革蘭氏陰性菌多種基因調(diào)控有關(guān)的cAMP是最有效的信號(hào)分子，微量的cAMP可使10%的微生物細(xì)胞培養(yǎng)出來。

(3) 原位仿生境培養(yǎng)策略：將微生物分散附著或包埋在特殊載體上，固定微生物細(xì)胞，但其代謝產(chǎn)物及信號(hào)分子可自由擴(kuò)散并相互利用[17-18]。該方法能最大限度保持微生物的群落特性及細(xì)胞之間的相互聯(lián)系，可以將大量微生物轉(zhuǎn)變?yōu)榭膳囵B(yǎng)微生物。該方法的優(yōu)點(diǎn)是既能純培養(yǎng)又能保留微生物的原生態(tài)特性，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)純培養(yǎng)的部分弱點(diǎn)。

(4) 采用非常規(guī)的電子供體與電子受體：在分離化能自養(yǎng)菌時(shí)，添加非常規(guī)的電子供體與受體，可以快速達(dá)到分離的目的。如以亞砷酸為電子供體，氧為受體，以CO2為唯一碳源，從廢棄的金屬礦中分離到化能自養(yǎng)菌 (NT-26)，后者能產(chǎn)生很多活性天然產(chǎn)物。另外，為了降低培養(yǎng)過程中優(yōu)勢(shì)菌種代謝所產(chǎn)生的過氧化物、自由基和一些拮抗物質(zhì)的毒害作用，在培養(yǎng)基中添加如丙酮酸鈉、甜菜堿、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等，可以降解這些毒性成分。超氧化物歧化酶和丙酮酸鈉的代謝產(chǎn)物NADH、H+可與超氧化物結(jié)合，從而降低了超氧化物對(duì)細(xì)胞的損傷。

1.2 沉默代謝途徑的激活

單株菌-多次級(jí)代謝產(chǎn)物 (One strain-many compounds，OSMAC) 策略強(qiáng)調(diào)通過改變培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和添加酶抑制劑等干擾因素來刺激微生物，激活不同的合成基因簇，挖掘其產(chǎn)生不同次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力，從而獲得骨架新穎、活性高的新化合物[19]。在抗結(jié)核藥物研發(fā)中，OSAMC策略具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可特異性對(duì)抗結(jié)核化合物進(jìn)行篩選。如利用OSAMC策略，在海洋細(xì)菌鏈霉菌屬sp.的發(fā)酵液中獲得多肽Cyclomarin A，其對(duì)MDR-TB與XDR-TB都有抗菌活性，且其作用靶標(biāo)為結(jié)核菌內(nèi)的ClPC1蛋白。下文將介紹常用的OSMAC策略。

1.2.1 稀土元素處理

在化工業(yè)稀土元素的重要性是眾所周知的，其對(duì)活細(xì)胞的生物作用則鮮為人知。稀土元素包括鈧、釔、鑭系元素在內(nèi)共17種元素，它們通過降解pppGpp (或ppGpp) 的方法，能夠提高抗生素的產(chǎn)量，并在激活細(xì)菌的沉默基因和低表達(dá)基因方面有重要作用[20]。pppGpp與ppGpp都是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可參與微生物的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)，其可與RNA聚合酶結(jié)合而直接影響RNA聚合酶與DNA形成開放復(fù)合體的穩(wěn)定性，從而抑制rRNA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。在溫和條件下，稀土金屬離子對(duì)pppGppp及ppGpp有較好的水解作用，進(jìn)而可以提高微生物基因表達(dá)，并最終會(huì)導(dǎo)致某些抗生素合成的增加。

1.2.2 改變微生物生長條件

不同的C/N比對(duì)菌體的生長繁殖以及次級(jí)代謝產(chǎn)物有很大的影響。碳源過多容易產(chǎn)生較低的pH環(huán)境，進(jìn)而影響微生物生長；碳源不足容易引起微生物自身的衰老和自溶。氮源過多會(huì)使微生物生長過旺，影響環(huán)境pH偏高，不利次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足則影響菌體繁殖量，進(jìn)而影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。鹽濃度也能影響微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。鹽濃度的高低直接影響體系滲透壓的大小，而適當(dāng)?shù)臐B透壓是微生物正常生長的保障。培養(yǎng)體系pH的變化影響微生物的代謝過程，導(dǎo)致次級(jí)代謝產(chǎn)物的差異性。體系pH值發(fā)生變化不僅對(duì)各種酶產(chǎn)生影響，還會(huì)影響膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，改變菌體對(duì)基質(zhì)的利用速率，從而影響菌的生長和產(chǎn)物的合成。利用酸脅迫 (pH≤5) 和堿脅迫 (pH≥10)，可以激活微生物在極端條件下才進(jìn)行表達(dá)的基因，進(jìn)而產(chǎn)生一些新的天然化合物。如從陸生及海洋耐酸真菌的酸性培養(yǎng)產(chǎn)物中獲得了具有抗甲型流感病毒、抗菌及細(xì)胞毒活性的聚酮和吲哚類生物堿[21]。

1.2.3 酶抑制劑

通過酶抑制劑的添加，選擇性地抑制代謝途徑中相關(guān)酶的活性，在抑制某些代謝途徑的同時(shí)，促進(jìn)其他通路相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成。使用靶向核糖體的鏈霉素與慶大霉素，及靶向RNA聚合酶的抗生素利福平與ppGpp，可以選擇性地使得核糖體蛋白S12及RNA聚合酶β亞單元進(jìn)行自發(fā)突變，進(jìn)而導(dǎo)致激活某些沉默的合成基因。在微生物培養(yǎng)基中添加組氨酸去乙?；敢种苿┬炼１桨费蹼克?、丁酸鈉與丙戊酸，及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮胞苷，可以對(duì)DNA進(jìn)行共價(jià)修飾并調(diào)控真核基因表達(dá)，進(jìn)而改變?nèi)蚪M水平的基因表達(dá)，并激活沉默的化合物合成基因。添加亞MIC (Minimum inhibitory concentration)濃度的抗生素甲氧芐啶，通過誘導(dǎo)沉默基因的表達(dá)，也可以誘導(dǎo)合成新的化合物。

1.2.4 混合培養(yǎng)

微生物的混合培養(yǎng)能夠發(fā)生協(xié)同或者拮抗作用，進(jìn)而使微生物產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、高活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這是近年來OSMAC策略在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物研究方面的新思路[22]。天然來源的抗生素多是由于微生物生存環(huán)境受到另一物種威脅而產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)武器，探索研究這一防御機(jī)制是尋找新抗生素資源非常有效的途徑。近年來，通過混合培養(yǎng)刺激菌株產(chǎn)生相應(yīng)的新代謝產(chǎn)物成為OSMAC策略中新的研究思路。

1.2.5 遺傳方法

在沉默代謝途徑的基因簇中，不僅包括合成基因，還包括一些必需的調(diào)控基因。這些調(diào)控基因的過量表達(dá)或缺失可以顯著影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成。因此，增加正調(diào)控基因的表達(dá)或阻斷負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)都可以有效地激活沉默基因簇表達(dá)，獲得新型次級(jí)代謝產(chǎn)物。如有研究者利用CRISPR-Cas9技術(shù)激活鏈霉菌中沉默的基因簇，并揭示出沉默基因中隱藏著潛在的化合物庫[23]。研究人員首先利用計(jì)算工具鑒定出沉默的生物合成基因簇，隨后利用CRISPR/Cas9技術(shù)將一種強(qiáng)啟動(dòng)子序列插入到想要激活的基因前面，促使細(xì)菌制造這些基因簇編碼的天然產(chǎn)物。利用此種方法，他們分離出一種具有新骨架的Ⅱ型聚酮類化合物并且確定了其分子式為C23H16O8，其具有的非對(duì)稱環(huán)己酮結(jié)構(gòu)在其他聚酮類化合物中還未曾發(fā)現(xiàn)。

2 抗結(jié)核活性天然產(chǎn)物的分離及其作用靶標(biāo)

天然產(chǎn)物的研究已進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代，微生物來源的天然產(chǎn)物已成為當(dāng)前抗結(jié)核藥研發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一[24]?；谏鲜龅难芯糠椒?，近年來在新型抗結(jié)核藥物篩選的研究中取得了很多令人欣喜的成果。如利用原位培養(yǎng)與iCHIP等方法，研究者獲得了幾個(gè)具有獨(dú)特作用靶標(biāo)及作用機(jī)制的天然產(chǎn)物，這些天然產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗耐藥結(jié)核菌活性，為新型抗結(jié)核藥物的篩選提供了模板和思路，我們著重介紹其中的Lassomycin、Ecumicin及泰斯巴汀(Teixobactin) (表1)。

Gavrish等[25]通過原位培養(yǎng)并延長培養(yǎng)時(shí)間的方法，從土壤微生物的發(fā)酵液中分離出化合物L(fēng)assomycin，其顯示出較高的抗結(jié)核活性，對(duì)結(jié)核菌包括MDR與XDR菌株的MIC值是0.8–3.0 μg/mL，MBC值為1–4 μg/mL。通過檢測(cè)抗菌譜發(fā)現(xiàn)，Lassomycin可選擇性地殺死結(jié)核菌，且對(duì)其他微生物無殺菌活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Lassomycin在結(jié)核菌內(nèi)的作用靶標(biāo)是ClpC1P1P2，后者是結(jié)核菌生長所必需的ATP依賴的蛋白酶，而且其他微生物中沒有編碼該蛋白的基因，其只存在于分枝桿菌屬的微生物中。Lassomycin可以結(jié)合到ClpC1P1P2的N末端口袋狀結(jié)構(gòu)中，并激活它的ATP酶活性，進(jìn)而導(dǎo)致ClpC1P1P2 處于活性蛋白酶狀態(tài)并開始降解結(jié)核菌細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵蛋白。這種通過激活胞內(nèi)蛋白酶 (而不是抑制) 而起到抑制病原菌的機(jī)制比較少見，預(yù)示Lassomycin很有希望作為抗結(jié)核藥物或藥物佐劑進(jìn)入臨床應(yīng)用，同時(shí)也為新抗結(jié)核藥物的設(shè)計(jì)提供了思路[26-27]。

表1 抗結(jié)核天然產(chǎn)物來源、活性及作用靶標(biāo)

通過高通量篩選的方法，研究人員從65 000種放線菌的萃取物中發(fā)現(xiàn)野野村氏菌sp. MJM5123能產(chǎn)生一種新的抗生素Ecumicin[28]，一個(gè)環(huán)形的13肽結(jié)構(gòu)。Ecumicin對(duì)結(jié)核菌的最小殺菌濃度為0.34 μmol/L。其對(duì)MDR、XDR及潛伏感染的結(jié)核菌均有殺滅活性，對(duì)其他病原微生物如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等沒有抑制活性，表明Ecumicin對(duì)結(jié)核菌也有特異的殺菌活性。與Lassomycin類似，Ecumicin也能解偶聯(lián)結(jié)核菌中ClpC1 ATPase復(fù)合物，進(jìn)而激活蛋白酶ClpP1P2的水解活性，造成結(jié)核菌由于蛋白的水解而被殺滅[29]。結(jié)核分枝桿菌通過Clp蛋白酶復(fù)合體可水解在環(huán)境壓力下形成的錯(cuò)誤折疊、不可逆損傷以及對(duì)自身有害的蛋白質(zhì)，從而保證結(jié)核分枝桿菌的穩(wěn)態(tài)，維持其在感染機(jī)體后的正常的生存和繁殖[30]。另一個(gè)ClPC1抑制劑是Cyclomarin A，其是由鏈酶菌sp.產(chǎn)生的多肽，共包含7個(gè)氨基酸殘基，其中3個(gè)為稀有氨基酸[31]。Cyclomarin A最早是在1999年分離得到，最初被確認(rèn)具有抗炎活性，但研究人員證明Cyclomarin A對(duì)MDR-TB與XDR-TB都有抗菌活性，其作用靶標(biāo)為結(jié)核菌內(nèi)的ClPC1蛋白[32]。通過與ClpC1結(jié)合導(dǎo)致后者結(jié)構(gòu)改變，并激活其蛋白酶活性，最后導(dǎo)致結(jié)核菌內(nèi)正常蛋白被降解，結(jié)核菌由于蛋白穩(wěn)定被破壞而死亡[33]。上述研究表明抗結(jié)核先導(dǎo)化合物的新型作用模式，闡釋了ClpC1作為結(jié)核菌的治療靶標(biāo)的美好研究前景[32]。后續(xù)研究人員又對(duì)該代謝產(chǎn)物進(jìn)行了一系列修飾，得到了Cyclomarin B、Cyclomarin C以及最近報(bào)道的Desoxycyclomarin C，藥物評(píng)價(jià)結(jié)果顯示了該類化合物巨大的抗肺結(jié)核藥物開發(fā)潛力[34]。

美國東北大學(xué)Kim Lewis研究小組通過對(duì)未培養(yǎng)微生物進(jìn)行原位培養(yǎng)，利用Ichip (Isolation chip，Ichip) 技術(shù)從未培養(yǎng)微生物β-變形桿菌的發(fā)酵液中分離到一種新型抗生素Teixobactin[31]。與糖肽類抗生素、羊毛硫抗生素及防御素的分子結(jié)構(gòu)不同，Teixobactin的分子結(jié)構(gòu)屬于縮酚酸肽，是第一個(gè)可以結(jié)合lipid Ⅱ的抗生素。利用Teixobactin對(duì)的突變庫進(jìn)行篩選，在低倍MIC濃度下依然沒有篩選出抗性菌株，表明Teixobactin的作用靶標(biāo)是結(jié)核菌中的必需基因所編碼，從而能夠避免的抗性產(chǎn)生，因此有較好的應(yīng)用前景。Teixobactin的作用機(jī)制是結(jié)合肽聚糖前體lipid Ⅱ和lipid Ⅲ，進(jìn)而抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成并達(dá)到抑制微生物的生長的作用。Teixobactin主要通過結(jié)合lipid Ⅱ的焦磷酸酯和多糖，從而阻斷細(xì)菌細(xì)胞壁的合成路徑。Lipid Ⅱ是一個(gè)非蛋白靶點(diǎn)，細(xì)菌不易通過突變產(chǎn)生耐藥，是目前發(fā)現(xiàn)的有效的抗菌靶點(diǎn)[35]；另外，lipid Ⅱ是細(xì)菌特有的成分，可大大降低lipid II抑制劑對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生毒性的可能性。此外，Teixobactin也作用于lipid Ⅲ，后者是細(xì)胞壁磷壁酸的合成前體，當(dāng)Teixobactin與lipid Ⅲ結(jié)合時(shí)，可導(dǎo)致自溶素被釋放，將肽聚糖層溶解，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。除抑制結(jié)核菌以外[36]，Teixobactin對(duì)其他革蘭氏陽性菌也有很好的抗菌活性，如對(duì)炭疽桿菌與艱難梭菌的最低抑菌濃度值達(dá)到納克級(jí)；另外其對(duì)多種耐藥菌如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant，MRSA) 和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌 (Vancomycin resistant，VRE) 等有效，MIC均在1 μg/mL以下[37]。

3 展望

耐藥結(jié)核菌感染已成為全人類的威脅，除了限制抗生素的濫用外，新型抗生素的研發(fā)也在緊鑼密鼓地展開。微生物品種繁多、代謝途徑多樣、遺傳可塑性強(qiáng)，是研制新藥取之不盡的寶庫。挖掘這些微生物資源，需要利用微生物非常規(guī)培養(yǎng)與沉默基因激活策略。如利用原位培養(yǎng)、營養(yǎng)限制培養(yǎng)及Ichip技術(shù)，從微生物代謝產(chǎn)物中獲得的具有抗結(jié)核菌活性的天然產(chǎn)物L(fēng)assomycin、Ecumicin 和Teixobactin，它們以Clp蛋白復(fù)合體或lipid Ⅱ?yàn)樽饔冒悬c(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。我們認(rèn)為，綜合利用上述方法繼續(xù)在微生物中尋找結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，并進(jìn)一步檢測(cè)這些化合物的抗結(jié)核活性，是抗結(jié)核藥物研究的一個(gè)重要方向。本實(shí)驗(yàn)室利用營養(yǎng)限制培養(yǎng)策略從微生物分散泛菌中分離到抗結(jié)核活性的化合物PantocinWH-1。PantocinWH-1為多肽結(jié)構(gòu)，分子量為1 927 Da，且對(duì)結(jié)核菌具有特異的殺滅活性，體內(nèi)試驗(yàn)也顯示出優(yōu)異的應(yīng)用前景。

此外，一些新的技術(shù)也可以用作未培養(yǎng)微生物與OSMAC策略的探索，如宏基因組學(xué)(Metagenomics與穩(wěn)定同位素(Stable isotope probing，SIP)[47]。宏基因組學(xué)是直接提取特定環(huán)境中的總DNA，并克隆到可培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中以構(gòu)建宏基因組文庫，從獲得的克隆當(dāng)中進(jìn)行功能篩選和序列篩選分析，文庫包含了可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)的微生物基因，避開了微生物分離培養(yǎng)等問題，極大地?cái)U(kuò)展了微生物資源的利用空間[48]。宏基因組學(xué)是研究未培養(yǎng)微生物、尋找新功能基因和開發(fā)獲得新活性物質(zhì)的重要新途徑，微生物及其天然產(chǎn)物的探索領(lǐng)域正在宏基因組的幫助下不斷擴(kuò)大[49]。如Gillespie等[50]利用細(xì)菌人工染色體載體pBeloBACII構(gòu)建了兩個(gè)土壤樣品的宏基因組文庫，獲得了兩個(gè)具有廣譜抗菌作用的新抗生素Turbomycin A和Turbomycin B?？梢灶A(yù)期其對(duì)抗結(jié)核藥物研發(fā)也具有較好的應(yīng)用前景。SIP 作為示蹤物，主要是標(biāo)記營養(yǎng)底物來培養(yǎng)微生物，如利用同位素15N或15N-13C標(biāo)記的氨基酸作為營養(yǎng)底物去培養(yǎng)微生物，進(jìn)而通過NMR檢測(cè)使用這些氨基酸合成的新的天然產(chǎn)物，目前多篇最新文獻(xiàn)報(bào)道了該方法的成功應(yīng)用[51-52]。鞠建華等從深海放線菌中發(fā)現(xiàn)了具有抗結(jié)核菌活性的系列物質(zhì)，通過SIP等技術(shù)優(yōu)化改造獲得低細(xì)胞毒活性、強(qiáng)抗結(jié)核菌活性的化合物——怡萊霉素E (IlamycinE)[46]。怡萊霉素E對(duì)結(jié)核菌H37Rv菌株的MIC值為9.8 nmol/L，是一線抗結(jié)核藥物利福平活性的30倍。怡萊霉素E對(duì)正常細(xì)胞的毒性較低，在抗結(jié)核活性和細(xì)胞毒性之間的選擇性指數(shù)為400–1 500，顯示出較好的安全性窗口，具有成藥潛力。

綜上，微生物非常規(guī)培養(yǎng)與沉默基因激活策略是發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核活性產(chǎn)物的重要方法。利用上述方法，研究人員已經(jīng)得到了數(shù)個(gè)具有應(yīng)用前景的天然產(chǎn)物，這些天然產(chǎn)物具有成為新型抗結(jié)核藥物的潛力。另外，隨著新的生物新技術(shù)方法的應(yīng)用 (如宏基因組學(xué)及SIP技術(shù))，微生物來源的天然產(chǎn)物篩選模式也發(fā)生了進(jìn)一步的變化。通過多種生物技術(shù)的交叉使用，微生物天然產(chǎn)物開發(fā)有望再次成為新藥開發(fā)的高產(chǎn)資源，為人類解除疾病和增進(jìn)健康提供更多更好的選擇。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Development of new anti-tuberculosis drugs: the strategy of unconventional microbial culture and silencing gene activation

Tieshan Teng1,2, Longxiang Xie1,2, and Jianping Xie2

1 Institute of Biomedical Informatics, School of Basic Medical Sciences, Henan University, Kaifeng 475004, Henan, China 2 State Key Laboratory Breeding Base of Eco-Environment and Bio-Resource of the Three Gorges Area, Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Institute of Modern Biopharmaceuticals, School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

Tuberculosis (TB), caused by, has become a major human infectious disease. The existing first-line and second-line TB drugs have poor treatment outcomes in patients with MDR-TB and XDR-TB. There is an urgent need for new and better drugs to treat tuberculosis due to lengthy and complex treatment regimens and a rising problem of drug resistance. Microbial-derived natural products have revealed enormous reservoirs of as yet untapped lead compounds. In this review, we discuss the strategies that have been developed in bacteria and fungi to isolation of non-culturable microorganisms and activation of silent biosynthetic gene clusters involved in the study of microbial-derived natural products. This review also highlights recent advances in microbial-derived natural products with anti-tuberculosis activity using these methods.

, un-cultured microorganisms, silent genes, one strain-many compounds (OSMAC)

December 30, 2017;

March 22, 2018

Natural Science Foundation of Education Department of Henan Province (No. 17A310015).

Jianping Xie. Tel: +86-23-68367108; E-mail: georgex@swu.edu.cn

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目 (No. 17A310015) 資助。

10.13345/j.cjb.170534