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    可溶性PD-1/PD-L1在食管鱗癌癌變過(guò)程中的表達(dá)及意義*

    2018-08-28 10:31:48朱曼周福有原翔郭曉鋒楊海軍
    中國(guó)醫(yī)學(xué)工程 2018年7期
    關(guān)鍵詞:分析

    朱曼,周福有,原翔,郭曉鋒,楊海軍

    (1.河南科技大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471003;2.河南省安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院 胸外科,河南 安陽(yáng) 455000;3.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)室,河南 洛陽(yáng) 471003;4.河南省安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院 病理科,河南 安陽(yáng) 455000)

    食管鱗癌是世界上常見的惡性腫瘤之一,其惡性程度高、疾病進(jìn)展快,嚴(yán)重威脅人類的身體健康。因此,尋求一個(gè)良好的早期診斷指標(biāo)或治療療效觀察指標(biāo)尤為重要。人類細(xì)胞程序性死亡受體-1/人類程序性死亡配體-1(programmed death 1/programmed death ligand 1,PD-1/PD-L1)與 腫 瘤的相關(guān)研究成果相繼報(bào)道,目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)人類可溶性細(xì)胞程序性死亡受體-1/人類可溶性程序性死亡配體 -1(soluble PD-1/PD-L1, sPD-1/sPD-L1)詳盡的研究報(bào)道較少見。因此,本文期望通過(guò)研究食管鱗癌癌變過(guò)程中外周血sPD-1/sPD-L1的表達(dá),為今后PD-1/PD-L1靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。

    1 資料與方法

    1.1 標(biāo)本來(lái)源

    選自2016年11月-2017年2月安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院體檢及診療人群,分正常對(duì)照組、食管鱗癌前病變組、食管鱗癌組3組,每組各90例,排除內(nèi)分泌、免疫及代謝疾病。正常對(duì)照組男56例,女34例;年齡42~70歲,平均(61.72±7.44)歲,標(biāo)本來(lái)源于本院體檢中心,經(jīng)胃鏡檢查排除食管鱗癌、癌前病變。食管鱗癌前病變組男53例,女37例;年齡47~68歲,平均(62.34±6.77)歲,其中低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變24例,高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變66例,標(biāo)本來(lái)源于內(nèi)鏡中心,經(jīng)活檢組織學(xué)確診。食管鱗癌組男59例,女31例;年齡45~74歲,平均(63.69±7.08)歲,TNM分期參照第8版食管癌TNM分期,標(biāo)本來(lái)源于胸外科住院手術(shù)病例,術(shù)后病理確診。3組性別、年齡組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨訪截止日期為2017年12月2日。隨訪率100.00%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南科技大學(xué)第四附屬醫(yī)院(安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并獲得受試者知情同意。

    1.2 主要儀器與試劑

    酶標(biāo)測(cè)定儀(Labsystems Multiskan MS-352,芬蘭)、離心機(jī)(安信AXTD5A型,中國(guó))、超低溫冷凍儲(chǔ)存冰箱(美菱,中國(guó))、洗板機(jī)(Thermo Labsystems AC8,芬蘭)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9080型,中國(guó)上海)。

    人類程序性死亡配體-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒(批 號(hào):2016041115A,96T/盒)、 人 類程序性死亡受體-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒(批號(hào):2016041116A,96T/盒),均購(gòu)自上海喬羽生物科技有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 標(biāo)本采集 空腹抽取靜脈血液5 ml,EDTA-K2抗凝,離心(3500轉(zhuǎn)/min)10 min,分離血漿,置-70℃冰箱保存待測(cè)。

    1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定外周血中sPD-1/sPD-L1的表達(dá)水平 按照試劑說(shuō)明書操作,用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),繪制sPD-1/sPD-L1的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,其相關(guān)性R2>0.99。計(jì)算每個(gè)樣本中sPD-1/sPD-L1的含量。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較比較用Pearson相關(guān)性分析,與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系用χ2檢驗(yàn),K-M法計(jì)算無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(progress free survival, PFS)。

    2 結(jié)果

    2.1 sPD-1 的濃度

    正常對(duì)照、食管鱗癌癌前病變、食管鱗癌患者外周血中的sPD-1分別為(601.66±92.52) pg/ ml、(636.62±125.79)pg/ml、(649.22±101.72) pg/ ml。正常對(duì)照組和食管鱗癌癌前病變組,正常對(duì)照組和食管鱗癌組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.030 ;0.003);食管鱗癌癌前病變組和食管鱗癌組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.433)。表明食管鱗癌癌前病變、食管鱗癌患者外周血sPD-1表達(dá)明顯升 高。

    2.2 sPD-L1 的濃度

    正常對(duì)照、食管鱗癌癌前病變、食管鱗癌患者外周血中的sPD-L1分別為(173.95±22.30) pg/ ml、(195.49±28.44)pg/ml、(219.05±27.98) pg/ ml。組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.000;0.000;0.000)。表明外周血sPD-L1的表達(dá)隨食管疾病的進(jìn)展明顯升高。

    2.3 三組外周血sPD-1和sPD-L1相關(guān)性分析

    正常對(duì)照組、食管癌前病變組和食管鱗癌組sPD-1/sPD-L1均 無(wú) 相 關(guān) 性(P =0.668;0.263;0.196),即兩者的升高并無(wú)一致性。

    2.4 食管鱗癌患者外周血sPD-1/sPD-L1與食管鱗癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

    分別選擇食管鱗癌患者外周血sPD-1/sPD-L1的中位數(shù)629.87 pg/ml、217.79 pg/ml為Cut Off值,低于此為低表達(dá),高于此為高表達(dá)(見表1),結(jié)果表明食管鱗癌患者外周血sPD-1的表達(dá)與食管鱗癌N分期密切相關(guān)(P =0.011)(見圖1),sPD-L1與腫瘤的最大徑密切相關(guān)(P =0.006)(見圖2)。

    2.5 食管鱗癌血清標(biāo)記分子的可能性初步分析

    運(yùn)用受試者操作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC) 對(duì)sPD-1/sPD-L1進(jìn)行分析,sPD-1對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的曲線下面積(area under curve, AUC)為0.616(95%可信區(qū)間為0.534~0.698)(P <0.05),sPD-1 對(duì)食管鱗癌的診斷有較低準(zhǔn)確性;正確診斷指數(shù)為549.66 pg/ml(見圖3)。sPD-L1對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的AUC為0.888(95%可 信 區(qū) 間 為 0.844~0.933)(P <0.05),sPD-L1對(duì)食管鱗癌的診斷有一定準(zhǔn)確性,正確診斷指數(shù)為194.355 pg/ml(見圖4)。

    2.6 生存分析

    依ROC曲線的正確診斷指數(shù)將sPD-1/sPD-L1分別分成正常組和高值組。隨訪率100%。sPD-1正常組和高值組的PFS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.081),sPD-L1正常組和高值組的PFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.026)(見圖5)。

    表1 食管鱗癌患者sPD-1/sPD-L1與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

    圖1 食管鱗癌患者外周血sPD-1的表達(dá)與食管鱗癌 N分期相關(guān)性分析

    圖2 食管鱗癌患者外周血sPD-L1與腫瘤的最大徑 相關(guān)性分析

    圖3 sPD-1的ROC曲線

    圖4 sPD-L1的ROC曲線

    圖5 據(jù)sPD-L1的水平分析食管鱗癌患者的PFS

    3 討論

    食管癌是我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)隨著人口增長(zhǎng)和老齡化加劇,發(fā)病率和死亡率居高不下[1]。手術(shù)是食管癌治療的最佳手段[2]。無(wú)論何種治療都會(huì)給患者帶來(lái)較大的副作用,影響患者的生活質(zhì)量,因此努力地探求早期診斷食管癌和有效的療效觀察指標(biāo)十分重要。

    程序性死亡受體-1(PD-1),是免疫球蛋白超家族成員[3],主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞。PD-1有兩個(gè)配體:程序性死亡配體-1(PD-L1)和程序性死亡配體-2(PD-L2)。PD-L1表達(dá)較廣泛,人體的免疫細(xì)胞、組織細(xì)胞和一些腫瘤細(xì)胞中均有。當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí),腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)PD-L1,與T淋巴細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合,激活PD-1/PD-L1信號(hào)系統(tǒng),抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活性,使T淋巴細(xì)胞阻滯在G0/G1期,阻礙其分化為漿細(xì)胞,從而引起T淋巴細(xì)胞的凋亡,激活腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4]。

    近年來(lái),PD-1/PD-L1與腫瘤的相關(guān)研究成果相繼報(bào)道:肺癌[5]、腎癌[6]、乳腺癌[7]、結(jié)直腸癌[8]、胃癌[9]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[10]及卵巢癌[11]的腫瘤組織中檢測(cè)到PD-1及PD-L1的高表達(dá)。同時(shí),PD-1或PD-L1抗體已經(jīng)應(yīng)用到臨床上治療黑色素瘤、卵巢癌及肺癌[5,7],并且取得了一定的臨床療效。Jiang等[12]發(fā)現(xiàn)組織中PD-L1的表達(dá)是食管鱗癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

    PD-1/PD-L1除了以細(xì)胞膜型存在,還以可溶性形式廣泛存在[13-14]。多項(xiàng)研究依靠ELISA的方法在腫瘤患者外周血中檢測(cè)到了PD-1/PD-L1的存在,鄭志雪等[15]發(fā)現(xiàn)sPD-L1水平在進(jìn)展期胃癌中顯著升高,其在腫瘤的免疫逃逸和患者預(yù)后中發(fā)揮重要作用;徐春[16]研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者外周血的表達(dá)水平明顯高于正常人,sPD-L1可以作為食管癌診斷的分子生物學(xué)標(biāo)記。

    本研究印證了食管鱗癌患者外周血中的sPD-L1顯著高于正常人,同時(shí)通過(guò)對(duì)比正常人群、食管癌前病變患者和食管鱗癌患者的血漿sPD-L1發(fā)現(xiàn)其隨疾病變化逐漸升高,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。sPD-1的濃度在食管癌前病變組和食管鱗癌組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P >0.05)。表明外周血sPD-1表達(dá)在食管疾病時(shí)升高,但是沒有隨食管疾病的進(jìn)展變化。

    對(duì)食管鱗癌患者sPD-1/sPD-L1的濃度與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系分析,發(fā)現(xiàn)sPD-1的表達(dá)與N分期密切相關(guān),sPD-L1與腫瘤的最大徑密切相關(guān)。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)sPD-1對(duì)食管鱗癌的診斷有較低準(zhǔn)確性;sPD-L1對(duì)食管鱗癌的診斷有一定的準(zhǔn)確性。依ROC曲線的正確診斷指數(shù)將sPD-1/sPD-L1分別分成正常組和高值組?;颊邿o(wú)失訪。sPD-1的PFS高值組較正常組無(wú)差異;sPD-L1的高值組的PFS低于正常組。隨訪時(shí)間較短,今后需要繼續(xù)跟蹤患者生存情況,進(jìn)一步分析。

    sPD-1/sPD-L1作為血漿中存在的一種可溶性蛋白,其血漿含量甚微,需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)的每個(gè)環(huán)節(jié),確保結(jié)果的真實(shí)有效。ELISA方法敏感性高、特異性強(qiáng)、可以對(duì)血漿中的微量蛋白精準(zhǔn)檢測(cè);同時(shí),血漿的提取過(guò)程如果摻入了白細(xì)胞層(尤其是淋巴細(xì)胞)可能會(huì)對(duì)結(jié)果有較大影響,因此需要嚴(yán)格把控靜脈采血量和離心時(shí)間,避免影響。

    綜上所述,sPD-1與食管鱗癌的發(fā)生有關(guān),sPD-L1與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有一定的關(guān)系。

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