河南省商丘地區(qū)棉花枯萎病菌的分子鑒定與致病力

婁喜艷　向文華　劉冬梅

摘要：以河南省民權(quán)縣花園鎮(zhèn)棉花枯萎病病株為材料，采用連續(xù)稀釋法和單孢分離法得到枯萎菌單孢菌株，對該菌株進行形態(tài)學和顯微形態(tài)學分析。采用真菌通用引物對所分離的菌株rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）PCR擴增得到 544 bp 大小的片段（GenBank登錄號為FJ715505），BLASTn分析結(jié)果顯示，該序列與其他枯萎菌的ITS序列具有很高的同源性，將該ITS序列與GenBank中搜索到的同源性序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，確定商丘地區(qū)棉花枯萎菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），對該分離棉花枯萎菌菌株進一步進行致病力生物學鑒定。

關(guān)鍵詞：棉花枯萎菌；單孢分離；ITS序列；致病力；分子鑒定；生物學鑒定；病害防治

中圖分類號： S4356212+4文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0086-03

收稿日期：2016-08-04

基金項目：國家自然科學基金（編號：31571997）；河南省高等學校重點科研項目（編號：16A210036）。

作者簡介：婁喜艷（1984—），女，河南商丘人，碩士，講師，從事植物生理學教學與研究。E-mail：lounan2005@163com。

棉花枯萎菌學名尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），屬半知菌亞門鐮刀菌屬，它是棉花上的重要病害，過去曾作為國內(nèi)重要植物檢疫對象，至今在有些?。ㄊ小^(qū)）仍作為植物檢疫對象。枯萎菌引起的枯萎病在棉花苗期和現(xiàn)蕾期前后常引起大量死苗，殘存的病株結(jié)鈴明顯減少，鈴質(zhì)量減輕直接影響棉花生產(chǎn)和棉農(nóng)收入。此病最早于1892年在美國發(fā)現(xiàn)，以后隨棉種調(diào)運而迅速擴散蔓延，目前在世界各主要產(chǎn)棉國均有發(fā)生。我國于1934年在江蘇南通和上海川沙等縣（市）最早發(fā)現(xiàn)此病，20世紀七八十年代初期，遍布全國各主要產(chǎn)棉區(qū)，并形成嚴重危害。20世紀80年代中期以后，隨大量抗病品種的推廣，枯萎病在我國南北棉區(qū)基本得到控制，但局部棉區(qū)發(fā)生仍然較重，其中特別是新疆棉區(qū)常造成大片死亡，目前仍是棉花生產(chǎn)上的一個重要問題。本試驗采集河南省商丘地區(qū)棉花枯萎病病株，分離棉花枯萎菌單孢菌株，進行菌落形態(tài)學和顯微形態(tài)學分析，并采用分子生物學的方法對該菌株核糖體DNA ITS序列進行鑒定，為進一步的棉花枯萎病的鑒定及防治提供科學的理論依據(jù)。

1材料與方法

11材料

河南省民權(quán)縣采集的棉花枯萎病病株。棉花感病品種為冀棉11，由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所提供。

12方法

121棉花枯萎菌的分離和純化

制備PDA培養(yǎng)基，倒平板；棉花病枝經(jīng)自來水沖洗，將棉花莖剝皮，在超凈工作臺上，將其切成長度為10～15 cm的圓柱體，用75%乙醇消毒 30 s 左右，無菌水沖洗，然后用01%氯化汞進行滅菌1 min，用無菌水沖洗2～3次；圓柱體切成4個切片或小薄片，每塊組織均應為病健相間變色的維管束組織；放入培養(yǎng)基平板上，輕輕按壓，每皿4塊，排放均勻；28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7～8 d。采用連續(xù)稀釋法[3]和單孢分離法[4]，純化分離菌株。

122棉花枯萎病菌形態(tài)學鑒定

肉眼觀察棉花枯萎菌菌株的菌落形態(tài)、生長狀況；制備水裝片，顯微觀察棉花枯萎菌菌絲、分生孢子、分生孢子梗等特征。

123棉花枯萎菌分子生物學鑒定

采用改良的CTAB的方法[5-6]提取枯萎菌DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的完整度；采用真菌核糖體ITS區(qū)段的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），對枯萎菌菌株進行PCR擴增。PCR擴增反應液25 μL，05 U/μL Taq聚合酶02 μL，dNTP的濃度為2 mmol/L；引物濃度為2 μmol/L，模板DNA 25 ng。反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，交由南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

124數(shù)據(jù)分析

通過軟件DNAMAN進行序列同源性分析。用NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//wwwncbinlmnihgov/）進行BLAST分析，從GeneBank中查找所需物種的不同地區(qū)枯萎菌ITS基因序列，通過MEGA 40以最大似然法構(gòu)建進化樹。

125分離棉花枯萎菌菌株致病性分析

棉花枯萎菌接種于查氏液體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫搖床培養(yǎng)14 d左右；4層滅菌紗布進行過濾枯萎菌培養(yǎng)液。血球計數(shù)板測量枯萎菌的小孢子密度，稀釋至100萬個/mL；當棉花幼苗生長到1葉1心時，將培養(yǎng)幼苗的塑料杯從托盤上拔起，進行斷根，放在枯萎菌菌液中進行侵染，感染后10～20 d開始觀察記錄。

2結(jié)果與分析

21枯萎菌菌落形態(tài)檢測結(jié)果

分離培養(yǎng)的枯萎菌，菌絲白色，菌落蓬松，長勢迅速?？菸【牟≡鸀榧怄哏牭毒?，萎蔫專化型，屬于半知菌亞門鐮刀屬。病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長時，菌絲體呈絨毛狀或棉絮狀，菌落初為白色，后變淡紫色至紫色（圖1）。

22枯萎菌顯微形態(tài)學鑒定

挑去分離的棉花枯萎菌菌絲制作水裝片于顯微下觀察，該菌株產(chǎn)生大型分生孢子，呈鐮刀形彎曲，具有3～5個分隔；產(chǎn)生的小型分生孢子多數(shù)為單孢，卵圓形。與鐮刀分類系統(tǒng)比較，確定為尖孢鐮刀菌。

23枯萎菌分子生物學鑒定

231ITS通用引物對菌株的PCR擴增

從圖2可以看出，以ITS1、ITS4為引物的PCR擴增產(chǎn)物條帶在500～750 bp之間，擴增條帶清晰、整齊。

232鐮刀菌rDNA ITS區(qū)序列比對

商丘的棉花枯萎菌菌株ITS區(qū)PCR擴增產(chǎn)物測序得到544 bp的片段，GenBank序列登記號為FJ715505。將該棉花鐮刀菌序列和來自世界各地（包括中國在內(nèi)）的20個具有代表性的鐮刀菌屬ITS序列進行比較，構(gòu)建棉花鐮刀菌的系統(tǒng)進化樹（圖3）。從圖4可以看出，在全世界范圍內(nèi)，河南商丘棉花鐮刀與印度、馬來西亞、希臘鐮刀菌聚在一起，親緣很近，而與美國北卡州、法國、墨西哥、澳大利亞菌株親緣關(guān)系稍遠，與南韓、哥倫比亞和意大利的親緣關(guān)系最遠；在中國范圍內(nèi)，與海南、南寧、貴陽、北京聚在一起，而與臺灣、廣州、杭州、雅安相距較遠，和最近的泰安菌株相距最遠。綜上結(jié)果分析，棉花鐮刀菌屬親緣關(guān)系遠近和地緣遠近無密切相關(guān)性。

24棉花枯萎菌致病力分析

分離的商丘枯萎菌接種棉花幼苗，對其致病力進行觀察分析。幼苗發(fā)病時葉片最先表現(xiàn)出癥狀，葉片邊緣或主脈呈現(xiàn)淡黃色不規(guī)則斑塊，隨后病斑逐漸擴大，變成褐色干枯并逐漸向上發(fā)展，最終侵染入植株的維管束系統(tǒng)，使整株植株發(fā)病死亡（圖4）[8]，與田間發(fā)病結(jié)果一致（圖1-a），均為青枯型。

3討論與結(jié)論

核糖體DNA（rDNA）ITS序列的保守性作為植物病原菌的分子鑒定檢測手段，已經(jīng)在植物病害鑒定的研究中得到廣泛[CM（25]應用。ITS是介于 18S、58S、28S rDNA 之間的區(qū)域， 該區(qū)域進化速度較編碼區(qū)快，在真菌種間存在豐富的變異，在種內(nèi)不同菌株間又高度保守，該區(qū)域DNA核苷酸序列的比較有助于相似種的鑒定。ITS序列已成為系統(tǒng)與進化生物學研究中的重要分子標記，并被廣泛應用于親緣關(guān)系較近分類群的系統(tǒng)發(fā)育研究[9]。因此，在對棉花枯萎菌形態(tài)學研究的基礎上進行ITS序列測定可以作為棉花枯萎菌鑒定的輔助手段，為其檢測提供快速有效的途徑。而進一步利用ITS序列設計種的特異性PCR引物可對棉花枯萎菌進行快速鑒定。

本試驗采集河南省商丘地區(qū)棉花枯萎病病株，分離出1株棉花枯萎菌單孢菌株進行菌落形態(tài)學和顯微形態(tài)學分析，并采用分子生物學的方法對該菌株核糖體DNA ITS序列進行鑒定，結(jié)果表明該菌株為尖孢鐮刀菌（F oxysporum），該試驗將為進一步的棉花枯萎病的鑒定及防治提供科學的理論依據(jù)。

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