從蠑螈到克隆猴：核移植研究90周年記

秦逸人

中國科學(xué)院生物與化學(xué)交叉研究中心，上海 201203

2018年2月中國科學(xué)家首次獲得體細(xì)胞克隆猴的研究報(bào)道，又一次將克隆動物繼Dolly羊以來推到了高潮，并再一次成為人們所討論的熱門話題。到底什么是動物克隆呢？

“克隆”一詞是英語單詞“clone”的中文翻譯，指無性繁殖，為不涉及生殖細(xì)胞直接由母體分裂而形成新個(gè)體的繁殖方式，在單細(xì)胞動物或者低等多細(xì)胞動物中普遍存在。更為高級的動物均為有性生殖，即由雌雄配子結(jié)合的受精卵發(fā)育而來，該生殖方式能夠讓基因組合廣泛變異，增加子代適應(yīng)自然選擇的能力。既然如此，為何我們要把更高級的生殖方式再返回到低等呢？又是通過什么方法做到的呢？

因?yàn)橛行陨车陌l(fā)育過程非常復(fù)雜，科學(xué)家便利用了無性生殖遺傳一致性的特點(diǎn)想搞清楚這一過程中的一系列科學(xué)問題，而實(shí)現(xiàn)這一過程的方法便是核移植 (nuclear transfer)。核移植，顧名思義，便知是將細(xì)胞核移植入另一種細(xì)胞的過程。這樣我們就明白了“克隆”是較為通俗的說法，而稱“核移植”則更為專業(yè)。正逢核移植研究90周年，為了讓大家能更深入地了解核移植研究，我特寫此文介紹一下核移植的重大科學(xué)發(fā)

展史。

1 人造雙胞胎動物研究為核移植提供思想和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

有性生殖動物均由雌雄配子結(jié)合的單細(xì)胞受精卵發(fā)育而來，然而受精卵分裂后的胚胎卵裂球是否依然具備此能力呢？以下人造雙胞胎動物實(shí)驗(yàn)研究便給了我們科學(xué)的解答。

1.1 第一例人造雙胞胎動物——海膽

1885年，德國生物學(xué)家Hans Driesch將棘皮動物門海膽 (無脊椎動物) 的2-細(xì)胞卵裂胚胎獨(dú)立分離開來，發(fā)現(xiàn)它們分別能發(fā)育為獨(dú)立的個(gè)體[1]，這是人類歷史上第一例人造雙胞胎動物(圖1)。

1.2 第一例人造雙胞胎脊椎動物——蠑螈

1902年，德國胚胎學(xué)家Hans Spemann在以上的海膽實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將蠑螈2-細(xì)胞胚胎用發(fā)絲結(jié)扎，分離為2個(gè)獨(dú)立的卵裂胚胎，發(fā)現(xiàn)其也能分別發(fā)育為獨(dú)立的個(gè)體[2]。這是第一例人造雙胞胎脊椎動物(圖2)。此外，Spemann也分離了更后期的胚胎卵裂球，發(fā)現(xiàn)其不能發(fā)育到個(gè)體。

以上科學(xué)實(shí)驗(yàn)清晰地回答了以下基本的科學(xué)問題：2-細(xì)胞胚胎時(shí)期的任何一個(gè)卵裂球均和受精卵一樣，具備發(fā)育為一個(gè)個(gè)體的能力，而后期的卵裂球不再具備。

圖1 Driesch (a) 與其海膽2-細(xì)胞胚胎分離實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綀D(b)

圖2 Speman (a)與其蠑螈2-細(xì)胞胚胎分離實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綀D(b)

2 核移植的重要發(fā)展歷程

2.1 第一例核移植動物——蠑螈

1928年，Spemann在上述人造雙胞胎實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上將蠑螈的受精卵不完全結(jié)扎，一半僅為胞質(zhì)，另一半含有原核，直到有核的一半發(fā)育到16細(xì)胞胚胎時(shí)將結(jié)扎線去掉，再擠壓一個(gè)卵裂胚胎的細(xì)胞核進(jìn)入到之前沒有細(xì)胞核的胞質(zhì)形成一個(gè)重構(gòu)胚胎，最后將此胚胎分離出來，發(fā)現(xiàn)其可以發(fā)育為一個(gè)個(gè)體[2-3](圖3)。這是人類史上第一次核移植實(shí)驗(yàn)，它給我們回答了以下重大科學(xué)問題：①分裂后的胚胎細(xì)胞在受精卵胞質(zhì)的作用下，可以完成一個(gè)個(gè)體的發(fā)育；②胚胎細(xì)胞核指導(dǎo)胚胎的發(fā)育過程，并非胞質(zhì)。

圖3 Spemann的核移植實(shí)驗(yàn)過程

另外，Spemann還推測：如果利用發(fā)育更晚期的胚胎細(xì)胞甚至一個(gè)個(gè)體的細(xì)胞進(jìn)行核移植，可能會獲得一個(gè)新的個(gè)體。因以上原創(chuàng)性的貢獻(xiàn)，Spemann榮膺1935年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎[4]。

2.2 第一例卵細(xì)胞誘導(dǎo)的核移植動物——林蛙

1952年，英國科學(xué)家Robert Briggs與Thomas Joseph King首次報(bào)道了以卵細(xì)胞為受體的核移植實(shí)驗(yàn)研究。他們的方法在Spemann的基礎(chǔ)上進(jìn)行了很大的改進(jìn)，發(fā)展了一個(gè)至今仍使用的核移植程序 (圖4)，即先去除林蛙(Rana pipiens)卵細(xì)胞核，再將分離的林蛙胚胎細(xì)胞核注射到去核卵細(xì)胞后獲得重構(gòu)胚胎。他們發(fā)現(xiàn)這一重構(gòu)胚胎能夠繼續(xù)發(fā)育為一個(gè)個(gè)體[5]，盡管效率很低 (同Spemann蠑螈核移植實(shí)驗(yàn)效率)，尤其是在利用發(fā)育更晚期的胚胎細(xì)胞作為供體時(shí)。該實(shí)驗(yàn)回答了以下重要科學(xué)問題：①細(xì)胞核直接指導(dǎo)細(xì)胞的生長和個(gè)體的發(fā)育；②早期胚胎細(xì)胞能更有效地用于核移植。

另外，他們還做了一項(xiàng)非常有趣的實(shí)驗(yàn)，即將牛蛙(Rana catesbeiana)的胚胎細(xì)胞核移植入林蛙的去核卵，發(fā)現(xiàn)該重構(gòu)胚胎能夠發(fā)育到囊胚期，但隨后停止發(fā)育，胚胎死亡。這可能是人類歷史上第一次異種核移植實(shí)驗(yàn)。

圖4 1952年Robert Briggs 與Thomas Joseph King在《美國科學(xué)院院刊》上報(bào)道的林蛙胚胎細(xì)胞核移植研究(a)與該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綀D(b)

2.3 第一例體細(xì)胞核移植動物——非洲爪蟾

1958年，英國科學(xué)家John Gurdon在林蛙胚胎細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上用非洲爪蟾 (Xenopus laevis)幼體腸細(xì)胞核移植入去核卵細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該胚胎也能夠發(fā)育為一個(gè)個(gè)體，而此個(gè)體的基因組與供體細(xì)胞的一致[6](圖5)。這是人類歷史上第一例體細(xì)胞核移植動物，它回答了以下重大科學(xué)問題：①一個(gè)分化的細(xì)胞在一定條件下能夠逆轉(zhuǎn)進(jìn)而再次發(fā)育為一個(gè)個(gè)體；②一個(gè)細(xì)胞含有所有遺傳物質(zhì)，即便是其發(fā)生了分裂或者分化。因以上原創(chuàng)性貢獻(xiàn)，John Gurdon榮膺2012年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

2.4 第一例哺乳動物核移植胚胎

兩棲類動物因體外受精，卵細(xì)胞較大，很容易體外實(shí)驗(yàn)操作；而哺乳動物體內(nèi)受精，卵細(xì)胞較小(約1/1000)，在體外操作時(shí)有很大的難度。1975年，英國科學(xué)家J. Derek Bromhall發(fā)展了一套哺乳動物核移植實(shí)驗(yàn)程序，他利用煅燒拉制的細(xì)玻璃管進(jìn)行操作，將兔的胚胎細(xì)胞核注射入去核卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)此重構(gòu)胚胎能夠發(fā)育到桑葚胚，這是首次哺乳動物核移植胚胎研究的報(bào)道[7](圖6)，預(yù)示了哺乳動物核移植獲得個(gè)體的可能性。

2.5 第一例核移植哺乳動物——綿羊

圖5 John Gurdon(a)與其1958年在《自然》發(fā)表的非洲爪蟾體細(xì)胞核移植研究(b)

圖6 1975年J. Derek Bromhall作為獨(dú)立作者在《自然》發(fā)表的兔核移植實(shí)驗(yàn)研究。圖中左下為兔卵細(xì)胞核移植操作過程，右下為發(fā)育到桑葚期的兔克隆胚胎

1986年，英國科學(xué)家Steen Willadsen將綿羊的8-細(xì)胞胚胎的一個(gè)卵裂球分離出來，然后與一個(gè)去核卵母細(xì)胞進(jìn)行電融合形成一個(gè)重構(gòu)胚胎，他們發(fā)現(xiàn)這一新的胚胎不僅能夠體外繼續(xù)發(fā)育，且在移植入受體子宮后，成功地獲得了3只存活的羔羊[8](圖7)。本研究為人類第一次獲得核移植哺乳動物，說明核移植操作在哺乳動物中是切實(shí)可行的。盡管他們用早期胚胎細(xì)胞作為核供體，但是為哺乳動物體細(xì)胞核移植提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖7 1986年Steen Willadsen作為獨(dú)立作者發(fā)表在《自然》的利用綿羊胚胎細(xì)胞核移植獲得克隆綿羊的研究

2.6 第一例核移植靈長類動物——恒河猴

1997年，Li Meng與Don Wolf等人利用以上綿羊的核移植方法，首次開展了對靈長類動物核移植的研究。他們發(fā)現(xiàn)恒河猴胚胎卵裂球與去核卵細(xì)胞形成的重構(gòu)胚胎不僅能在體外進(jìn)行卵裂發(fā)育，且移植入受體猴子宮后成功地獲得了2只健康存活的個(gè)體[9](圖8)。這是第一例核移植靈長類動物，為體細(xì)胞克隆猴提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.7 第一例體細(xì)胞核移植哺乳動物——Dolly

1997年Ian Wilmut與Keith Campbell等在胚胎細(xì)胞核移植綿羊的基礎(chǔ)上，利用成年芬多斯母羊乳腺上皮細(xì)胞與蘇格蘭黑面母羊去核卵細(xì)胞進(jìn)行電融合獲得重構(gòu)胚胎，發(fā)現(xiàn)其能夠在體外繼續(xù)發(fā)育桑葚和囊胚期，然后將這些胚胎移植入受體羊子宮后，成功地獲得1只存活的羔羊[10](圖9)。這是人類歷史上的首個(gè)體細(xì)胞核移植克隆哺乳動物，科學(xué)家命名它為Dolly，其社會影響力巨大，也成為了家喻戶曉的“明星”。

2.8 體細(xì)胞克隆哺乳動物俱樂部

自克隆羊Dolly誕生后，體細(xì)胞核移植的可行性在其他不同物種也相繼得到了證實(shí)。截至目前，在正式國際學(xué)術(shù)期刊報(bào)道的健康存活的體細(xì)胞克隆哺乳動物除Dolly之外，還有以下19種：牛(1998年)[11]、小鼠(1998年)[12]、山羊(1999年)[13]、豬(2000年)[14]、歐洲盤羊(2001年)[15]、家兔(2002年)[16]、家貓(2002年)[17]、馬(2003年)[18]、大鼠(2003年)[19]、騾子(2003年)[20]、非洲野貓(2004年)[21]、狗(2005年)[22]、雪貂(2006年)[23]、狼(2007年)[24]、水牛(2007年)[25]、紅鹿(2007年)[26]、單峰駱駝(2009年)[27]，以及最近的非人靈長類長尾獼猴(2018年)[28]等(圖10)。其中，水牛和獼猴的克隆完全在中國本土完成(分別為廣西大學(xué)和中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所)，而克隆大鼠和雪貂的主要完成人均為中國科學(xué)家(論文第一作者)，這說明我國在核移植研究領(lǐng)域處在國際領(lǐng)先地位。

另外，有2個(gè)新的異種克隆物種存在異常，即克隆印度野牛[29](家牛卵細(xì)胞，2000年) 與克隆雙峰駱駝[30](單峰駱駝卵細(xì)胞，2017年)，前者在妊娠202天流產(chǎn)，后者在出生7天后死亡。

圖9 1997年Ian Wilmut與Keith Campbell等在《自然》上以封面文章形式報(bào)道了利用成年綿羊乳腺母細(xì)胞核移植獲得的克隆羊Dolly

2.9 第一例冷凍死尸來源的克隆動物——小鼠

2008年，日本科學(xué)家Teruhiko Wakayama(他首次報(bào)道獲得了克隆小鼠[12]) 等報(bào)道了將完全沒有冷凍保護(hù)劑、在-20 ℃冷藏16年的小鼠尸體成功地克隆復(fù)制[31]。在該項(xiàng)研究中，他們先用死尸的各種不同組織分離的細(xì)胞核移植，發(fā)現(xiàn)只有大腦來源的細(xì)胞其核移植胚胎體外發(fā)育和獲得胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)的效率最高。然后再利用大腦細(xì)胞來源的核移植ESCs作為供體細(xì)胞核移植(連續(xù)核移植)，獲得了4只克隆小鼠，其中2只具備正常生育功能(圖11)。這項(xiàng)突破性的研究解答了以下重要問題：①長期冷藏的死亡個(gè)體即使其所有細(xì)胞已全部死亡，只要其遺傳物質(zhì)不降解，就可以被克隆復(fù)制；②為物種整個(gè)基因組的有效儲存提供新的思路和方法；③為復(fù)活古生物提供思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.10 第一例體細(xì)胞核移植靈長類動物——長尾獼猴

2018年，中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所孫強(qiáng)與劉真等報(bào)道利用長尾獼猴胎兒皮膚成纖維細(xì)胞核移植，成功地獲得了2只健康的克隆個(gè)體，被命名為“中中”和“華華”[28](圖12)。這是人類史上第一次獲得的體細(xì)胞克隆靈長類動物。因非人靈長類動物被認(rèn)為是人類疾病最好的研究模型，利用克隆這一遺傳一致性的特點(diǎn)便消除了傳統(tǒng)模型猴的個(gè)體差異，故該項(xiàng)研究具有重大科學(xué)意義。

圖10 首次報(bào)道的體細(xì)胞克隆哺乳動物 (各動物照片均出自原始論文)。從左往右、從上往下依次為Dolly、牛、小鼠、山羊、豬、歐洲盤羊、家兔、家貓、非洲野貓、大鼠、雪貂、狗、狼、水牛、騾子、紅鹿、單峰駱駝、馬及長尾獼猴

圖11 2008年Teruhiko Wakayama等將完全沒有冷凍保護(hù)、在-20 ℃冷凍16年的小鼠尸體成功地克隆

另外值得我們思考的是：從胚胎細(xì)胞核移植綿羊 (1986) 到體細(xì)胞克隆羊Dolly (1997) 僅用了11年，從胚胎細(xì)胞核移植猴 (1997) 到體細(xì)胞克隆猴卻經(jīng)歷了21年，而利用成年個(gè)體體細(xì)胞(卵丘細(xì)胞)沒有獲得成功。這充分地說明最高級的靈長類動物的克隆并不像其他低等哺乳動物那樣簡單，不僅需要更高的技術(shù)和難度，還需要更深入的科學(xué)探討。故自克隆猴誕生后，筆者將體細(xì)胞克隆動物的發(fā)展進(jìn)程分為以下三個(gè)階段 (圖13)：第一階段，自1958年開始報(bào)道的兩棲類動物的體細(xì)胞克隆研究；第二階段，自1997年開始報(bào)道的低等哺乳動物的體細(xì)胞克隆研究；第三階段，自2018年開始報(bào)道的非人靈長類動物的體細(xì)胞克隆研究。

圖12 2018年2月《細(xì)胞》以封面文章形式報(bào)道了中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所孫強(qiáng)與劉真等利用長尾獼猴胎兒皮膚成纖維細(xì)胞核移植獲得的克隆猴“中中”和“華華”

圖13 體細(xì)胞克隆動物的發(fā)展進(jìn)程可分三個(gè)階段：第一階段，自1958年開始報(bào)道的兩棲類動物克?。坏诙A段，自1997年開始報(bào)道的低等哺乳動物克??；第三階段，自2018年開始報(bào)道的非人靈長類動物克隆

如果說體細(xì)胞克隆猴不具有重大創(chuàng)新僅為換了物種的Dolly羊重復(fù)，那么Dolly又是否為胚胎細(xì)胞核移植綿羊換了一種供體細(xì)胞、是否為體細(xì)胞核移植爪蟾換了一個(gè)物種呢？針對這些問題，我們可以在上述核移植的發(fā)展歷程中找到答案：科學(xué)創(chuàng)新并不是沒有基礎(chǔ)的突發(fā)性飛躍，而是緩慢積累的循序式漸進(jìn)；并不是來自沒有依據(jù)的無知遐想和天馬行空，而是來自對現(xiàn)有科學(xué)知識的批判和繼承。

3 核移植在其他方面的重大科學(xué)突破

我們把上述利用核移植獲得克隆動物的研究稱為生殖性克隆，如克隆家畜、克隆寵物、拯救瀕危物種、獲得遺傳一致的動物模型等。除此之外，利用核移植也可以研究其他重大科學(xué)問題，如獲得病人來源的胚胎干細(xì)胞、阻斷線粒體疾病的下一代遺傳、提高高齡婦女卵細(xì)胞質(zhì)量、獲得體外培養(yǎng)和遺傳操作的“精子”、獲得多倍體研究模型、研究基因組的穩(wěn)定性、研究細(xì)胞重編程機(jī)制、解答表觀遺傳學(xué)的基礎(chǔ)問題等等。下面就這些方面所做出的重大成果進(jìn)行闡述。

3.1 治療性克隆

治療性克隆相對生殖性克隆而言，指體細(xì)胞克隆胚胎不移植入受體而是在體外分離出干細(xì)胞的過程，我們將此干細(xì)胞稱為核移植ESCs。如果利用病人來源體細(xì)胞核移植獲得干細(xì)胞，這為量身定做，在理論上不存在免疫排斥，具有巨大的臨床應(yīng)用前景。在iPSCs (induced pluripotent stem cells)[32]出現(xiàn)之前，核移植是能夠?qū)Ⅲw細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎扼w多能干細(xì)胞的唯一方法，而iPSCs的出現(xiàn)為我們提供了另一種途徑。這時(shí)治療性克隆的研究開始放緩，主要原因?yàn)椋旱谝?，核移植研究的要求較高，不僅需要更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，而且需要高超的實(shí)驗(yàn)技術(shù)；第二，人卵細(xì)胞的應(yīng)用受到限制。然而，在iPSCs出現(xiàn)7年后，人核移植ESCs終于獲得成功[33]，又一次將治療性克隆推到了熱點(diǎn)上。盡管iPSCs具備更多的優(yōu)勢，如實(shí)驗(yàn)過程更加簡捷和普及 (如今商品化的iPS試劑盒能讓普通的實(shí)驗(yàn)室也能完成)等，但核移植ESCs更接近于自然重編程受精卵來源的ESCs[34]，且無基因修飾，臨床應(yīng)用可能更為安全可靠。因此，核移植ESCs與iPSCs可以進(jìn)行優(yōu)勢互補(bǔ)來開展研究。下面筆者就概括一下治療性克隆的發(fā)展歷程和所取得的重大突破。

(1)第一例體細(xì)胞核移植ESCs

2001年，Teruhiko Wakayama等在其克隆小鼠的基礎(chǔ)上，首次報(bào)道了在成年小鼠體細(xì)胞克隆胚胎中分離出了具備多能性特征且生殖系傳遞(germline transmission)的核移植ESCs[35](圖14)，為人核移植ESCs的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

(2)第一例靈長類體細(xì)胞核移植ESCs

2007年，美國Oregon國家靈長類研究中心的Shoukhrat Mitalipov等報(bào)道了在成年恒河猴皮膚成纖維細(xì)胞核移植的克隆胚胎中，成功地分離獲得了2枚ESCs，其不僅有正常的核型，且具備體內(nèi)外三胚層分化的多能性[36](圖15)。這是第一例靈長類體細(xì)胞核移植ESCs。

圖14 2001年Teruhiko Wakayama等在《科學(xué)》報(bào)道了利用小鼠克隆胚胎分離出的ESCs

圖15 2007年Shoukhrat Mitalipov等在《自然》以封面文章報(bào)道了獲得成年恒河猴皮膚來源的核移植ESCs

(3)第一例人類體細(xì)胞核移植ESCs

2013年，Shoukhrat Mitalipov等在其恒河猴核移植ESCs的基礎(chǔ)上報(bào)道了利用人胎兒皮膚成纖維細(xì)胞核移植，在克隆胚胎中成功地獲得了4枚有正常二倍體核型和具備多能性的核移植ESCs[33](圖16)。這是第一例獲得的人核移植ESCs。隨后，有更多的實(shí)驗(yàn)室也報(bào)道了獲得正常成年人[37]、糖尿病[38]及老年性黃斑變性[39]病人體細(xì)胞來源的核移植ESCs，讓治療性克隆再一次成為熱點(diǎn)。

3.2 線粒體疾病的下一代預(yù)防

線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)突變引起的線粒體遺傳病為母系遺傳，通過卵細(xì)胞可以再傳遞給下一代，傳統(tǒng)的輔助生殖方法無法做到預(yù)防，而核移植便給我們提供了思路，即通過受精卵原核互換或患者卵細(xì)胞核(或極體)移植入健康去核卵細(xì)胞便可剔除突變的mtDNA，進(jìn)而預(yù)防下一代的發(fā)病。不過利用此方法會使正常卵細(xì)胞捐獻(xiàn)者的mtDNA傳給患者的下一代，故此嬰兒被認(rèn)為存在1父2母的倫理問題。

(1)第一例線粒體替代的靈長類動物

2009年，Shoukhrat Mitalipov等報(bào)道了將獼猴的卵細(xì)胞紡錘體取出移植入另一獼猴去核卵細(xì)胞的卵周隙，然后通過電融合的方法獲得新的卵細(xì)胞。1～2 h后，在重構(gòu)卵胞質(zhì)中注入精子完成受精。最后將受精胚胎移植入受體子宮，成功產(chǎn)下2個(gè)健康的獼猴[40](圖17)。這是首例通過卵細(xì)胞核移植獲得的線粒體替代靈長類動物，為人類線粒體疾病研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖16 2013年Shoukhrat Mitalipov等在《細(xì)胞》報(bào)道了利用人胎兒皮膚獲得人核移植ESCs的研究。在以往基礎(chǔ)上他們改進(jìn)了研究方法，主要為利用高質(zhì)量的卵細(xì)胞和咖啡因來提高效率

圖17 2009年Shoukhrat Mitalipov等在《自然》上報(bào)道了通過獼猴卵細(xì)胞核移植獲得的首例線粒體替代靈長類動物

(2)第一例線粒體替代嬰兒

2017年美國新希望生殖中心(私立機(jī)構(gòu)) 張進(jìn)等正式詳細(xì)地報(bào)道了(2006年的簡短報(bào)道未透露細(xì)節(jié))利用以上獼猴線粒體替代方法，將mtDNA突變的Leigh氏綜合征攜帶者卵細(xì)胞紡錘體移植入正常捐獻(xiàn)者去核卵細(xì)胞構(gòu)成一個(gè)新卵，再注入其丈夫的精子獲得受精胚胎。對此胚胎進(jìn)行遺傳篩查后進(jìn)行胚胎移植，成功地獲得一個(gè)健康男嬰[41](圖18)。這是世界上首例利用卵細(xì)胞核移植方法獲得的“三親嬰兒”，但因倫理問題張進(jìn)遭到美國FDA警告。

圖18 2017年張進(jìn)等正式報(bào)道了利用Leigh氏綜合征攜帶者卵細(xì)胞紡錘體移植獲得的健康嬰兒

3.3 體外培養(yǎng)和遺傳操作的“精子”

上述所提及的研究方法均為在去核卵中注入胚胎細(xì)胞或體細(xì)胞或卵細(xì)胞核，如果注入一個(gè)精子會是什么結(jié)果呢？2012年中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所李勁松研究員(筆者的博士后導(dǎo)師)與徐國良研究員課題組合作報(bào)道了這樣的研究[42]，即在小鼠的去核卵細(xì)胞中注射一個(gè)精子，然后對其進(jìn)行激活和培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該重構(gòu)胚胎不僅能體外發(fā)育到囊胚階段，且能從該胚胎中分離出ESCs，然后通過流式細(xì)胞儀分選，成功地獲得了單倍體細(xì)胞，稱為孤雄單倍體ESCs，重要的是將此細(xì)胞注入完整卵細(xì)胞中時(shí)，發(fā)現(xiàn)其和精子一樣，發(fā)生受精并可發(fā)育為一個(gè)個(gè)體。另外，對孤雄單倍體ESCs進(jìn)行體外遺傳修飾再受精后，也可獲得遺傳操作的小鼠(圖19)。這是人類史上第一次將精子轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蝮w外長期培養(yǎng)和遺傳操作的具備生殖功能的單倍體干細(xì)胞，具有重大的科學(xué)意義。該項(xiàng)研究也是國內(nèi)生命科學(xué)領(lǐng)域?yàn)閿?shù)不多的原創(chuàng)性突破。

4 結(jié)語

自第一例核移植動物到第一例體細(xì)胞核移植靈長類，核移植研究恰好迎來90周年，在這接近百年的研究歷程中，其不僅回答了一系列重大科學(xué)問題，且在許多方面已投入到了實(shí)際應(yīng)用(圖20)。然而，核移植研究還有諸多問題亟待解決：

(1)體細(xì)胞核移植效率仍然很低，主要表現(xiàn)在：①克隆動物出生率依然在5%以下(臨床IVF嬰兒出生率≥50%)，而目前體細(xì)胞克隆猴僅來自胎兒皮膚細(xì)胞，成年體細(xì)胞卻無法獲得；②異種克隆幾乎很難獲得健康的個(gè)體；③人核移植ESCs的效率也很低，目前僅有幾家實(shí)驗(yàn)室才能做到。

(2)核移植的表觀重編程機(jī)制了解甚少，目前的大部分研究停留在獲得克隆個(gè)體的表象上，在機(jī)制方面深入探討的研究卻極少，這也是核移植效率得不到大幅提高的根本原因。如果這一問題得不到解決，體細(xì)胞克隆猴也很難作為普及的動物模型，而復(fù)制猛犸象更僅僅是人類的幻想。

(3)線粒體疾病的替代治療存在倫理問題，這也是阻礙其臨床廣泛推廣的主要原因。

隨著科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，作為一名核移植研究工作者，筆者相信以上問題會取得突破。

圖19 2012年李勁松與徐國良等在《細(xì)胞》報(bào)道了利用核移植方法將精子轉(zhuǎn)變?yōu)槟茉隗w外培養(yǎng)和基因修飾的且具備生殖功能的單倍體ESCs

圖20 核移植大事記年表 (以上時(shí)間均為正式期刊報(bào)道日期)。其中第一例核移植動物和第一例體細(xì)胞核移植動物的研究成果分別榮膺1935年和2012年諾貝爾獎(Nobel Prize, NP)

(2018年5月4日收稿)■