雷帕霉素靶蛋白：細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控之門(mén)

郭曉強(qiáng)

北京大學(xué) 深圳醫(yī)院， 廣東 深圳 518036

細(xì)胞每時(shí)每刻都面臨生死存亡的艱難抉擇，于是自然進(jìn)化出一種機(jī)制以有效地適應(yīng)周?chē)h(huán)境。營(yíng)養(yǎng)豐富并同時(shí)存在生長(zhǎng)信號(hào)時(shí)，細(xì)胞可促進(jìn)糖分解代謝，同時(shí)啟動(dòng)蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和核苷酸等細(xì)胞組分合成以滿足快速生長(zhǎng)的需求；相反，營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，細(xì)胞減少物質(zhì)合成，暫停生長(zhǎng)以度過(guò)環(huán)境脅迫。最初認(rèn)為這一轉(zhuǎn)化為自發(fā)過(guò)程，不受細(xì)胞調(diào)控，直到一個(gè)“偶然”發(fā)現(xiàn)——雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin, TOR)的成功鑒定才改變了這一觀念[1]。

1 雷帕霉素的發(fā)現(xiàn)

故事可追溯至20世紀(jì)60年代。當(dāng)時(shí)，從自然界中尋找天然抗菌化合物是許多制藥公司的研究策略之一。1964年，一個(gè)加拿大科學(xué)探險(xiǎn)小組造訪了南太平洋小島——復(fù)活島(Easter Island)，又名拉帕努伊島(Rapa Nui)。這個(gè)太平洋小島保持著原生態(tài)，并且充滿著神秘感。一方面，島上矗立著諸多的石刻“巨人像”，代表著曾經(jīng)的文明；另一方面，當(dāng)?shù)厝司哂歇?dú)特的生活方式，他們大都赤腳生活，卻極少感染破傷風(fēng)等。研究人員據(jù)此推測(cè)，復(fù)活島人生活的環(huán)境中一定存在可抑制破傷風(fēng)桿菌等細(xì)菌生存的某種物質(zhì)。為此，他們從島上收集大量土壤標(biāo)本(包括當(dāng)?shù)靥赜械姆啪€菌和真菌等)并帶回加拿大，將其中一部分給予加拿大蒙特利爾的愛(ài)爾斯特制藥公司(Ayerst pharmaceutical company)微生物研究團(tuán)隊(duì)。

1972年，愛(ài)爾斯特制藥公司資深研究員塞加爾(Surendra Nath Sehgal, 1932.2.10—2003.1.21)從復(fù)活島收集的吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中分離得到一種具有強(qiáng)烈抗真菌活性的新化合物[2]，為紀(jì)念發(fā)源地而將其命名為雷帕霉素(rapamycin)(圖1)。雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物，體外對(duì)多種真菌(如念珠菌等)具有抑制作用。然而，塞加爾在進(jìn)一步開(kāi)展藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，口服雷帕霉素具有巨大的副作用，可強(qiáng)烈抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)，這一意想不到的結(jié)果使塞加爾開(kāi)始關(guān)注雷帕霉素的其他作用。塞加爾在期待進(jìn)一步研究雷帕霉素新的藥物作用時(shí)，卻面臨來(lái)自公司的巨大壓力。起初，愛(ài)爾斯特公司以整體發(fā)展規(guī)劃為由限制雷帕霉素的優(yōu)先研究地位。更為嚴(yán)重的是，1983年公司關(guān)閉蒙特利爾研究中心，解散員工，雷帕霉素的研究完全終止。

圖1 雷帕霉素的發(fā)現(xiàn)。雷帕霉素由塞加爾從復(fù)活島土壤標(biāo)本中分離得到，是一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物

2 FKBP12

20世紀(jì)70年代，隨著器官移植手術(shù)的推廣和普及，免疫抑制劑的市場(chǎng)需求大增，眾多公司將研發(fā)重點(diǎn)轉(zhuǎn)向這一新興領(lǐng)域。1983年，環(huán)孢素(ciclosporin)被批準(zhǔn)用于肝臟和腎臟等器官移植中，從而進(jìn)一步激發(fā)了這方面的研發(fā)熱情。1987年，一家日本研究機(jī)構(gòu)從土壤真菌——筑波鏈霉菌(Streptomyces tsukubaensis)中提取到一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，命名為他克莫司(Tacrolimus)，又名FK506。體外實(shí)驗(yàn)表明FK506也具有較強(qiáng)的免疫抑制特性，且活性是環(huán)孢素的幾十倍，被看好作為新一代免疫抑制劑。與此同時(shí)，1987年，愛(ài)爾斯特制藥公司被惠氏公司(Wyeth)收購(gòu)，從而重啟塞加爾的雷帕霉素研究計(jì)劃?？紤]到雷帕霉素和FK506均屬大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物，并且結(jié)構(gòu)相似，因此研究人員也對(duì)雷帕霉素的免疫抑制劑前景充滿期望。在開(kāi)展動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，這些藥物的作用機(jī)制也引起他們的極大興趣。

1988年，哈佛大學(xué)化學(xué)家施瑞伯(Stuart L.Schreiber,1956.2.6—)開(kāi)始研究FK506和環(huán)孢素的作用機(jī)制。施瑞伯采用經(jīng)典生物化學(xué)方法，以FK506為誘餌尋找其結(jié)合蛋白，從而篩選到FKBP12(FK506-binding protein)[3]。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明雷帕霉素也可與FKBP12結(jié)合。然而令人迷惑的是，兩種化合物具有不同的生理效應(yīng)，意味著FKBP12并非兩種化合物發(fā)揮活性的真正靶點(diǎn)。施瑞伯據(jù)此推測(cè)，F(xiàn)K506或雷帕霉素需首先和FKBP12形成復(fù)合物，然后再通過(guò)細(xì)胞內(nèi)未知靶點(diǎn)發(fā)揮生理效應(yīng)。因此，尋找真正靶點(diǎn)成為接下來(lái)迫切需要解決的重大問(wèn)題。施瑞伯拔得頭籌，進(jìn)一步使用FK506- FKBP12做誘餌鑒定出鈣神經(jīng)素(calcineurin)為FK506作用的真正靶點(diǎn)(圖2)。就在施瑞伯等多家實(shí)驗(yàn)室沿著這條道路尋找雷帕霉素作用靶點(diǎn)時(shí)，一位研究人員卻搶先一步取得突破。

圖2 FKBP12的發(fā)現(xiàn)。FK506是一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，施瑞伯篩選到它的結(jié)合蛋白FKBP12，并鑒定出其作用靶點(diǎn)為鈣神經(jīng)素

3 雷帕霉素作用靶點(diǎn)TOR

1987年，美國(guó)/瑞士分子生物學(xué)家霍爾(Michael Nip Hall, 1953.6.12—)在瑞士巴塞爾大學(xué)以酵母為實(shí)驗(yàn)材料研究真核生物核蛋白定位機(jī)制，由于實(shí)驗(yàn)不順而決定尋求其他研究項(xiàng)目?；魻柵c瑞士當(dāng)?shù)氐纳降率?Sandoz)制藥公司有一定的合作，獲悉免疫抑制劑的研究動(dòng)態(tài)，竟異想天開(kāi)決定使用酵母研究它們的作用機(jī)制。盡管許多人對(duì)此提出質(zhì)疑，認(rèn)為這一研究無(wú)疑是給酵母喂阿司匹林，屬無(wú)稽之談，但對(duì)具有酵母研究背景的霍爾而言，他“別無(wú)選擇”，只能?chē)L試。事實(shí)證明，恰恰是酵母這一看似“不經(jīng)意”的選擇卻成就了霍爾的重大突破。

由于酵母根本就沒(méi)有高等動(dòng)物傳統(tǒng)意義上的免疫系統(tǒng)，大多數(shù)人都不會(huì)想到酵母還可用來(lái)研究免疫抑制劑的作用。酵母最大的優(yōu)勢(shì)在于20世紀(jì)70年代已建立突變庫(kù)，從而使功能基因快速篩選和鑒定成為可能。當(dāng)時(shí)主流研究思路是利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞，用雷帕霉素-FKBP12為誘餌來(lái)純化其結(jié)合蛋白，然后分析蛋白質(zhì)部分序列，根據(jù)序列推測(cè)基因片段，進(jìn)一步獲得基因全長(zhǎng)，最終得到完整蛋白信息。酵母研究思路則與此不同，首先從酵母突變庫(kù)篩選具有雷帕霉素抗性的突變體，從而獲得基因信息，進(jìn)一步推測(cè)蛋白質(zhì)信息。從“基因到蛋白”比從“蛋白到基因再到蛋白”大大節(jié)省了時(shí)間，而且令大家始料不及的是雷帕霉素靶蛋白“巨大無(wú)比”，酵母優(yōu)勢(shì)更為明顯，從而使得后出發(fā)的霍爾團(tuán)隊(duì)卻率先取得突破。

研究項(xiàng)目主要由博士后黑特曼(Joseph Heitman)完成。黑特曼發(fā)現(xiàn)，正常酵母用雷帕霉素處理后紛紛死去，大部分酵母突變體也難逃厄運(yùn)，然而在此情形下，仍有極個(gè)別酵母突變體(18個(gè))躲過(guò)這一“滅頂之災(zāi)”，艱難存活下來(lái)。這些存活的酵母一方面使霍爾科研“存活”下來(lái)，另一方面也成為揭開(kāi)生命奧秘的關(guān)鍵鑰匙。黑特曼對(duì)18個(gè)酵母突變體分析后發(fā)現(xiàn)，15個(gè)都是相同基因突變，而這個(gè)突變基因編碼的恰恰就是前期在哺乳動(dòng)物中找到的FKBP12同源蛋白FPR1，證明雷帕霉素作用方式在真核生物具有高度保守性，也證實(shí)霍爾當(dāng)初實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可行性。與哺乳動(dòng)物結(jié)果一致的是，酵母FPR1突變后并不影響酵母生長(zhǎng)，只對(duì)雷帕霉素產(chǎn)生抗性，進(jìn)一步證明FKBP12/ FPR1并非雷帕霉素直接靶點(diǎn)，而是發(fā)揮協(xié)助作用。

黑特曼對(duì)剩余3株突變酵母分析后發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)應(yīng)兩種以前未曾闡明功能的新基因，這三株酵母不僅對(duì)雷帕霉素具有抗性，而且酵母本身生長(zhǎng)也受到極大影響，因此推測(cè)它們與雷帕霉素直接相關(guān)。在命名兩個(gè)新基因方面，黑特曼依據(jù)三字母原則列舉諸多候選，包括TOR(target of rapamycin)、TFR(target for rapamycin)、FAP(FKBP associate protein)、PAF(protein associated with FKBP)等，經(jīng)深思熟慮和比較分析后最終選定TOR，這兩個(gè)基因也就相應(yīng)地稱(chēng)為T(mén)OR1和TOR2。從字面理解，TOR直接反映它的作用，即雷帕霉素靶蛋白；而深層內(nèi)涵還預(yù)示它重要的生理功能。在德語(yǔ)中，TOR是“門(mén)控”(gate)之意，因此說(shuō)明TOR是細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的控制之門(mén)。1991年，這一成果發(fā)表在著名的美國(guó)《科學(xué)》雜志上[4]，從而開(kāi)啟雷帕霉素機(jī)制研究的大門(mén)(圖3)。

隨后，霍爾的學(xué)生孔茲(Jeannette Kunz)在克服重重困難后完成酵母TOR1和TOR2基因的克隆和測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因同源性極高，并且分子量巨大，編碼蛋白質(zhì)分子量大于280 kD，是一種全新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[5]。需提及的是，前史克比徹姆制藥公司(SmithKline Beecham Pharmaceuticals)利文(George Livi)也獨(dú)立克隆到酵母TOR基因[6]。

4 mTOR

霍爾成果發(fā)表1年后，多個(gè)研究小組幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白。施瑞伯小組以牛腦勻漿為材料，使用雷帕霉素-FKBP12復(fù)合物為誘餌純化FKBP-雷帕霉素相關(guān)蛋白(FKBPRAP-associated protein, FRAP)，序列分析表明其與酵母TOR1/2具有高度同源性[7]。1990年，年輕的薩巴蒂尼(David M. Sabatini, 1968.1.27—)進(jìn)入約翰霍普金斯大學(xué)著名神經(jīng)生理學(xué)家斯奈德(Solomon Snyder)的實(shí)驗(yàn)室，他敏銳地意識(shí)到雷帕霉素的重要性，因此選擇探索雷帕霉素的作用機(jī)制作為研究?jī)?nèi)容，最終于1994年從大鼠大腦鑒定出雷帕霉素與FKBP12靶蛋白(rapamycin and FKBP12 target, RAFT)[8]。梅奧醫(yī)學(xué)中心(Mayo Clinic)亞伯拉罕(Robert T. Abraham)小組也獲得相同結(jié)果，由于該蛋白與霍爾在酵母中發(fā)現(xiàn)的TOR同源，將其命名為mTOR(mammalian targets of rapamycin, mTOR)[9]。確切地說(shuō)，還有另外兩家實(shí)驗(yàn)室也取得同樣的進(jìn)展[9]。這一事實(shí)說(shuō)明當(dāng)時(shí)許多科研人員已意識(shí)到雷帕霉素的重要性，而且不同實(shí)驗(yàn)室之間競(jìng)爭(zhēng)異常激烈。據(jù)說(shuō)施瑞伯直接飛到倫敦，把稿件交到《自然》雜志辦公室，以免耽擱發(fā)表。后來(lái)，在果蠅、線蟲(chóng)等多種真核生物中也鑒定出TOR，奇怪的是只有酵母存在兩個(gè)TOR基因(TOR1/2)，而包括人在內(nèi)的絕大多數(shù)真核生物只有一個(gè)TOR基因。由于多家實(shí)驗(yàn)室鑒定出雷帕霉素靶蛋白，命名上多種多樣，為避免混淆， 2009年將其統(tǒng)稱(chēng)為mTOR，有時(shí)也代表雷帕霉素作用靶點(diǎn)(mechanistic target of rapamycin)。從這個(gè)角度而言，包含酵母在內(nèi)多個(gè)非哺乳動(dòng)物的TOR都可統(tǒng)稱(chēng)為mTOR。

圖3 TOR的發(fā)現(xiàn)?；魻栐诮湍钢需b定出雷帕霉素的靶蛋白TOR

mTOR屬磷酸肌醇-3′-激酶相關(guān)激酶(phosphatidylinositol 3′-kinase-related kinase,PIKK)家族成員，在C端含有一個(gè)典型PIKK激酶結(jié)構(gòu)域，但與大多數(shù)PIKK成員不同的是，該結(jié)構(gòu)域具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，而非脂類(lèi)激酶活性(圖4)。此外，mTOR的N端擁有一個(gè)多達(dá)20個(gè)串聯(lián)重復(fù)的HEAT結(jié)構(gòu)域，其主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)間相互作用，如此眾多的HEAT結(jié)構(gòu)域也暗示其在形成多種復(fù)合物中的重要性。mTOR結(jié)構(gòu)另一獨(dú)特之處在于中間有段FKBP12-雷帕霉素結(jié)合結(jié)構(gòu)域FRB，正是該區(qū)域被FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物識(shí)別和結(jié)合，從而抑制mTOR蛋白激酶活性?；魻柡Y選到的TOR突變體就是源于這一區(qū)域關(guān)鍵位點(diǎn)突變引起。mTOR重要性在多個(gè)物種都得到體現(xiàn)，酵母TOR1/2功能缺失性突變可造成生長(zhǎng)停滯，而小鼠TOR基因敲除可引起胚胎致死。

圖4 mTOR蛋白結(jié)構(gòu)[10]

5 mTORC

盡管mTOR分子本身非常巨大，然而它在行使功能時(shí)仍需多個(gè)輔助分子參與。2002年，霍爾首次在酵母中發(fā)現(xiàn)兩種TOR復(fù)合物(TOR complex, TORC)[11]，分別為T(mén)ORC1和TORC2。TORC1對(duì)雷帕霉素敏感，核心成分為T(mén)OR1或TOR2；而TORC2則對(duì)雷帕霉素敏感性差，核心成分卻只能是TOR2。這一事實(shí)也印證了霍爾的早期發(fā)現(xiàn)，即酵母TOR1基因突變表型不明顯，而TOR2突變嚴(yán)重阻滯酵母細(xì)胞生長(zhǎng)，原因就在于TOR2可代替TOR1功能，但反之則不行。不久，薩巴蒂尼在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)mTORC1和mTORC2[12]，當(dāng)然兩種復(fù)合物都只能含有mTOR，區(qū)別在于輔助因子。

mTORC1除含mTOR外，還包含mTOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白(regulatory associated protein of mTOR,raptor)和mLST8等，而mTORC2則由mTOR、雷帕霉素不敏感伴侶蛋白(rapamycin insensitive companion of mTOR, Rictor)、mSIN1等多種因子構(gòu)成。兩種mTORC介導(dǎo)不同信號(hào)通路并執(zhí)行不同生理功能(圖5)。

圖5 兩種mTORC及其調(diào)控作用

6 mTOR調(diào)控機(jī)制

mTOR常被看作細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控的中樞，甚至被霍爾譽(yù)為“細(xì)胞大腦”。mTOR具有傳感器作用：一方面可感知外界信號(hào)，既包括營(yíng)養(yǎng)信息如氨基酸等(適用于酵母等低等生物)，又包含生長(zhǎng)信號(hào)如激素和生長(zhǎng)因子等(適用于高等生物)；另一方面將這些信息經(jīng)過(guò)加工整合后進(jìn)一步通過(guò)調(diào)節(jié)下游信息最終實(shí)現(xiàn)生理效應(yīng)，如影響細(xì)胞生長(zhǎng)和器官發(fā)育等[13]。

(1)上游信號(hào)及調(diào)控機(jī)制

mTOR活性受多種因素的影響和調(diào)控。

營(yíng)養(yǎng)物調(diào)控 環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)成分含量可影響mTORC1活性，其中關(guān)于氨基酸的作用研究最為清晰。氨基酸可激活一種位于溶酶體膜表面的GTP酶Rag，從而將mTORC1招募到溶酶體表面執(zhí)行生物功能。

生長(zhǎng)因子調(diào)控 多種生長(zhǎng)因子可通過(guò)特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷酸化mTORC1抑制因子TSC1/2(tuberous sclerosis complex 1/2)，這一磷酸化修飾可解除抑制活性，從而激活mTORC1信號(hào)通路。

胰島素調(diào)控 mTORC2活性主要受胰島素-PI3K信號(hào)通路調(diào)控，但細(xì)節(jié)尚需闡明。

其他因子調(diào)控 mTORC還受營(yíng)養(yǎng)脅迫、低氧、DNA損傷信號(hào)等調(diào)控。

(2)下游底物及生理效應(yīng)

mTORC1促進(jìn)蛋白質(zhì)合成 這一作用最早于1997年發(fā)現(xiàn)。作為蛋白激酶的mTOR可催化多種蛋白底物磷酸化，其中包括蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程兩個(gè)關(guān)鍵因子——核糖體S6激酶1(ribosomal S6 kinase 1, S6K1)和真核轉(zhuǎn)錄因子4E結(jié)合蛋白(eIF4E-binding protein 1, 4E-BP)。磷酸化S6K1可進(jìn)一步磷酸化并激活多種涉及蛋白質(zhì)翻譯起始和延伸等多個(gè)過(guò)程的蛋白因子。4E-BP正常情況下發(fā)揮翻譯抑制作用，而磷酸化修飾可解除抑制活性，進(jìn)而增加核糖體翻譯效率和蛋白質(zhì)合成數(shù)量。

mTORC1促進(jìn)脂類(lèi)合成 細(xì)胞生長(zhǎng)、更新和分裂需要源源不斷的脂類(lèi)提供不溶于水的膜性成分，因此對(duì)脂類(lèi)需求急劇增加。mTORC1可通過(guò)激活關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子固醇應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(sterol responsive element binding protein, SREBP)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR γ)等促進(jìn)脂類(lèi)合成。

mTORC1促進(jìn)核酸合成 細(xì)胞分裂的基礎(chǔ)是染色體加倍，因此作為DNA和RNA基本成分的核苷酸自然必不可少。mTORC1可增加一碳單位代謝和嘌呤從頭合成過(guò)程關(guān)鍵酶的活性，最終達(dá)到增加核苷酸合成的目的。

mTORC1影響糖代謝 激活的mTORC1增加了蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和核苷酸等的合成代謝，因此必然增加原料需求。這些原料來(lái)源之一是糖代謝中間產(chǎn)物，因此mTORC1可促進(jìn)細(xì)胞糖代謝從有氧氧化向糖酵解和磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)化，以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖需要。

mTORC1抑制細(xì)胞自噬 細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)含物降解并重新利用的過(guò)程，涉及多種物質(zhì)的分解代謝。激活的mTORC1可通過(guò)抑制自噬形成關(guān)鍵因子ULK1的活性而減少自噬發(fā)生。此外，mTORC1還可通過(guò)抑制蛋白酶體活性而減少蛋白質(zhì)降解。

mTORC2促進(jìn)細(xì)胞遷移 目前，對(duì)mTORC2下游元件理解有限，普遍認(rèn)可的觀點(diǎn)是可激活PKC和Akt等多個(gè)蛋白激酶，從而增加細(xì)胞遷移能力。

7 mTOR信號(hào)通路的生理與病理作用

mTORC信號(hào)通路參與眾多生命過(guò)程，包括糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)、肌肉功能、脂內(nèi)穩(wěn)態(tài)、免疫機(jī)能和大腦發(fā)育(如突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶過(guò)程)[10]，而活性異常可導(dǎo)致癌癥等疾病發(fā)生。

(1)長(zhǎng)壽

2003年，首次以線蟲(chóng)為材料發(fā)現(xiàn)mTORC信號(hào)通路與長(zhǎng)壽相關(guān)。TOR基因失活突變或利用RNA干擾技術(shù)降低TOR mRNA含量，可使線蟲(chóng)比正常未處理線蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)一倍[14]。第二年，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制果蠅mTORC信號(hào)通路相關(guān)分子活性也顯著延長(zhǎng)壽命。這一結(jié)果在酵母和哺乳動(dòng)物如小鼠中也得到驗(yàn)證，即降低mTORC信號(hào)可達(dá)到延長(zhǎng)壽命效果。

20世紀(jì)30年代起，研究人員先后發(fā)現(xiàn)卡路里限制(calorie restriction, CR)可延長(zhǎng)酵母、線蟲(chóng)、果蠅、小鼠和狗等多種生物壽命，然而對(duì)這一現(xiàn)象背后的機(jī)制卻知之甚少。mTOR活性抑制與長(zhǎng)壽因果關(guān)系的發(fā)現(xiàn)啟發(fā)科學(xué)家開(kāi)始探索CR與mTOR間的關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)卡路里限制相當(dāng)于營(yíng)養(yǎng)限制，在此狀況下mTOR酶活性被明顯抑制，細(xì)胞生長(zhǎng)受阻。其實(shí)，mTOR抑制與長(zhǎng)壽的關(guān)聯(lián)一定程度也可用海夫利克極限(Hayflick Limitation)來(lái)解釋。海夫利克極限認(rèn)為，正常細(xì)胞體外培養(yǎng)壽命并非無(wú)限，而是有限增殖，因此抑制mTOR活性，降低細(xì)胞組分合成，減緩細(xì)胞分裂，從而使細(xì)胞周期間隔時(shí)間延長(zhǎng)，在細(xì)胞增殖次數(shù)固定前提下，無(wú)疑使細(xì)胞壽命延長(zhǎng)。

mTOR信號(hào)通路與長(zhǎng)壽關(guān)系的發(fā)現(xiàn)為延緩生理性衰老或治療病理性衰老及相關(guān)綜合征如神經(jīng)退行性疾病等提供了新思路[15]，當(dāng)然這一策略是否有效尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

(2)癌癥

隨著mTOR與細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖關(guān)系的發(fā)現(xiàn)，研究人員開(kāi)始關(guān)注這一信號(hào)通路與癌癥的關(guān)聯(lián)。許多著名癌基因如PI3K、AKT和Ras等的蛋白產(chǎn)物均為mTOR上游激活性調(diào)節(jié)因子，常常發(fā)生功能獲得性突變；而多個(gè)抑癌基因如PTEN、LKB1和TSC1/TSC2等蛋白產(chǎn)物則具有mTOR負(fù)調(diào)節(jié)作用，往往發(fā)生失活性突變。兩類(lèi)突變可產(chǎn)生相似結(jié)果，即造成mTOR信號(hào)通路過(guò)度激活，細(xì)胞出現(xiàn)惡性增殖[16]。多種癌癥包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、腎癌和腦腫瘤等均存在mTOR活性增強(qiáng)現(xiàn)象，這一發(fā)現(xiàn)可為癌癥治療提供新策略。

(3)其他

mTOR信號(hào)通路異常還可導(dǎo)致糖尿病、心腦血管疾病、肥胖、癲癇、自閉癥和阿爾茨海默病等發(fā)生。

8 mTOR信號(hào)通路的臨床應(yīng)用

(1)器官移植

雷帕霉素具有抑制抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞和B-細(xì)胞增殖以及抗體生成作用，這一特性使雷帕霉素于1999年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于腎移植患者術(shù)后器官排斥反應(yīng)的預(yù)防。雷帕霉素又名西羅莫司(Sirolimus)，商品名雷帕鳴(Rapamune)。

(2)腫瘤治療

20世紀(jì)70年代，塞加爾就意識(shí)到雷帕霉素可能具有抗癌作用，因此將部分試劑寄送到美國(guó)國(guó)立癌癥研究院(National Cancer Institute, NCI)進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示雷帕霉素確實(shí)可抑制多種腫瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)。NCI基于這一結(jié)果而將雷帕霉素提升到優(yōu)先研究化合物。

然而，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素具有水溶性較差、難吸收以及嚴(yán)重免疫抑制副作用等缺陷而限制其廣泛應(yīng)用。為解決這一難題，多家制藥公司積極開(kāi)發(fā)水溶性好的雷帕霉素類(lèi)似物(rapamycin analogs, rapalogs)，以雷帕霉素結(jié)構(gòu)骨架為基礎(chǔ)，通過(guò)修改取代基方式合成一系列衍生物，進(jìn)一步對(duì)其抑癌活性和毒性進(jìn)行篩選。兩個(gè)最成功的化合物為塞加爾所在惠氏公司開(kāi)發(fā)的CCI-779和諾華公司的RAD001。CCI-779正式名為替西羅莫司(Temsirolimus)，商品名馱瑞塞爾(Torisel)，2007年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性腎癌治療。RAD001正式名為依維莫司(Everolimus)，商品名阿飛尼妥(Afinitor)，2009年被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于腎癌的治療[17]。此外，依維莫司還應(yīng)用于乳腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤等治療。

雷帕霉素類(lèi)似物既可直接阻斷腫瘤細(xì)胞增殖，又可通過(guò)抑制新血管生成減少腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)而發(fā)揮間接殺傷效果，雙重效應(yīng)使藥效最大化。然而，臨床應(yīng)用顯示雷帕霉素類(lèi)似物對(duì)大多數(shù)實(shí)體瘤只有溫和的殺傷作用，治療效果遠(yuǎn)無(wú)法達(dá)到預(yù)期，原因在于mTORC2對(duì)這些化合物不敏感。

為克服雷帕霉素類(lèi)似物的臨床局限，研究人員也在積極探索改進(jìn)策略，主要從兩方面入手：一方面開(kāi)發(fā)新型mTOR抑制劑，另一方面嘗試與其他手段聯(lián)合治療。目前，正在研制多種ATP競(jìng)爭(zhēng)性mTOR抑制劑[18]，它們優(yōu)勢(shì)在于可同時(shí)阻斷mTORC1和mTORC2活性，以解決mTORC2對(duì)傳統(tǒng)抑制劑不敏感造成的治療抵抗。雷帕霉素類(lèi)似物可與化療藥物(如紫杉醇、多柔比星等)聯(lián)合，也可與芳香化酶抑制劑合用治療乳腺癌等。目前，針對(duì)mTOR信號(hào)通路的腫瘤靶向治療策略仍在改善中。

(3)其他

2015年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)西羅莫司應(yīng)用于淋巴管平滑肌瘤(lymphangioleiomyomatosis, LAM)治療，從而使西羅莫司成為第一種LAM治療藥物。LAM是一種由于TSC2突變進(jìn)而激活mTOR信號(hào)通路而造成的罕見(jiàn)進(jìn)行性肺部疾病，主要影響育齡婦女。

9 展望

從20世紀(jì)60年代菌株收集開(kāi)始，到今天mTOR信號(hào)通路的闡明和臨床應(yīng)用，跨越半個(gè)多世紀(jì)，中間經(jīng)歷雷帕霉素分離及生物作用發(fā)現(xiàn)(抗癌和免疫抑制)、雷帕霉素作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)(酵母TOR1/2基因的鑒定和克隆)、mTOR信號(hào)生物學(xué)作用和分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)等重大突破(圖6)。

雷帕霉素和mTOR信號(hào)通路的闡明極大地提升了對(duì)細(xì)胞和機(jī)體生理學(xué)的理解和認(rèn)識(shí)，深化對(duì)多種生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)，特別是對(duì)多種疾病預(yù)防和治療也具有革命性的意義。在此過(guò)程中，霍爾的貢獻(xiàn)至關(guān)重要，他也因此榮獲多項(xiàng)科學(xué)大獎(jiǎng)，著名的包括首屆生命科學(xué)突破獎(jiǎng)(2014年)、加拿大蓋爾德納國(guó)際獎(jiǎng)(2015年)和有“諾貝爾獎(jiǎng)風(fēng)向標(biāo)”之稱(chēng)的美國(guó)拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)(2017年)。霍爾也是近幾年諾貝爾獎(jiǎng)的有力爭(zhēng)奪者。

mTOR信號(hào)通路研究歷程為我們帶來(lái)三點(diǎn)啟示。首先是重大突破難預(yù)見(jiàn)性。在雷帕霉素生物作用研究和酵母TOR1/2基因克隆時(shí)無(wú)法估計(jì)到開(kāi)創(chuàng)一個(gè)全新研究領(lǐng)域，尤其是霍爾的發(fā)現(xiàn)更是遠(yuǎn)超預(yù)期。其次是模式生物的重要性?；魻柦淌谥阅茉诩ち业目茖W(xué)競(jìng)爭(zhēng)中脫穎而出，一個(gè)重要原因是選擇了“明星級(jí)”模式生物——酵母[19]。最后是生命系統(tǒng)的復(fù)雜性。盡管對(duì)mTOR在疾病中的作用已有廣泛的理解，但針對(duì)mTOR的治療效果仍差強(qiáng)人意，意味著從實(shí)驗(yàn)室研究到臨床應(yīng)用還有巨大差距，提示應(yīng)慎重看待許多生命科學(xué)“重大突破”的真正臨床價(jià)值。

圖6 雷帕霉素研究歷程

(2017年12月13日收稿)■