“人造精子”介導(dǎo)半克隆技術(shù)的建立與應(yīng)用

晏萌，李勁松

①中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，上海 200031；②中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院GTP中心，上海 200031

“人造精子”是近些年來科學(xué)家利用先進(jìn)的胚胎操作技術(shù)創(chuàng)造的一種可以替代精子，使卵細(xì)胞“受精”，并能產(chǎn)生出正常后代的單倍體胚胎干細(xì)胞。其背后凝結(jié)著科學(xué)家對干細(xì)胞技術(shù)和細(xì)胞顯微操作技術(shù)的探索，以及動(dòng)物胚胎發(fā)育和各種相關(guān)學(xué)科的理論完善，如胚胎發(fā)育學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和表觀遺傳學(xué)。本文就來講述 “人造精子”的來源、半克隆技術(shù)的發(fā)展，以及“人造精子”在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1 什么是精子？

想要了解什么是“人造精子”，首先要知道什么是精子。按照定義上來說，精子是男性的生殖細(xì)胞，英文名稱sperm來源于希臘文sperma，意思為種子。高等動(dòng)物的有性生殖靠精子和卵細(xì)胞結(jié)合，從而形成合子，再由合子經(jīng)過一系列有規(guī)律的細(xì)胞分裂與分化過程，最終發(fā)育成一個(gè)成熟的下一代個(gè)體，而精子所攜帶的父親一方的基因也由此遺傳至下一代[1]。成熟的小鼠精子分為4個(gè)部分：頭部，包含被頂體包裹的致密化細(xì)胞核；頸部，主要包含精子的中心粒；中段，包含了軸絲和大量外圍的線粒體，可以產(chǎn)生大量ATP，為精子在母體中的運(yùn)動(dòng)提供能量；尾部或者鞭毛，是精子的主要運(yùn)動(dòng)部位。

動(dòng)物的精子形成過程叫作精子發(fā)生，這一過程主要是在雄性性腺(睪丸的曲細(xì)精管)中進(jìn)行的，由精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells)經(jīng)過減數(shù)分裂產(chǎn)生[2]。精原干細(xì)胞經(jīng)過一次不對稱的有絲分裂產(chǎn)生兩種細(xì)胞：一種是A類型的細(xì)胞，實(shí)際上就是精原干細(xì)胞自身，用來維持精原干細(xì)胞的數(shù)量；另一種是B類型的細(xì)胞，可以分化為初級(jí)精母細(xì)胞。初級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂一期分裂為兩個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞，兩個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞隨后經(jīng)過減數(shù)分裂二期分裂為兩個(gè)精細(xì)胞(圖1)。高等動(dòng)物體細(xì)胞中包含有兩套完整的基因組信息，稱作二倍體細(xì)胞(2N)。例如：人體細(xì)胞包含22對常染色體和一對性染色體XY，一共46條染色體；小鼠體細(xì)胞則包含19對常染色體和一對性染色體XY，一共40條染色體。包含兩套完整的基因組信息就使得如果一條染色體上的基因發(fā)生突變另一條染色體上的基因可以彌補(bǔ)，從而保證生物體的正常生長發(fā)育。男性的體細(xì)胞中性染色體包括一條X染色體和一條Y染色體，而女性的體細(xì)胞中則是兩條X染色體。從精子發(fā)生的過程看，精原干細(xì)胞和精母細(xì)胞都是二倍體細(xì)胞(2N)，精母細(xì)胞在減數(shù)分裂前會(huì)進(jìn)行DNA的復(fù)制，成為四倍體(4N)；經(jīng)過減數(shù)分裂一期和減數(shù)分裂二期兩次細(xì)胞分裂過程，由四倍體分裂為只含有一套基因組信息的精細(xì)胞，并且只含有一條性染色體X或者Y，因此精細(xì)胞是單倍體細(xì)胞(1N)[3]。精細(xì)胞再經(jīng)過一系列復(fù)雜的精子形成過程，變形成為可以游動(dòng)的成熟精子(1N)，儲(chǔ)存在附睪中(圖1)。卵細(xì)胞也是一種單倍體細(xì)胞(1N)，因女性的性染色體含有兩條X染色體，所以卵細(xì)胞中也只有一條X染色體，當(dāng)精子與卵子結(jié)合后成為合子，又重新變成二倍體細(xì)胞(1N+1N=2N)。因此，由合子經(jīng)過有絲分裂和生長發(fā)育產(chǎn)生的成熟個(gè)體還是二倍體個(gè)體(2N)，保證了生物體的延續(xù)。

圖1 精子發(fā)生過程和人造精子形態(tài)。精原干細(xì)胞(2N)經(jīng)過一次有絲分裂形成一個(gè)初級(jí)精母細(xì)胞(2N)，再經(jīng)過減數(shù)分裂一期和二期，形成4個(gè)精細(xì)胞(1N)，最終變形為成熟精子?！叭嗽炀印痹谕庥^上類似于未成熟的球形精子，在結(jié)構(gòu)上不具備成熟精子的復(fù)雜特化結(jié)構(gòu)，但是保持了自我復(fù)制及受精的能力

2 什么是“人造精子”？

成熟的精子是單倍體細(xì)胞(1N)，“人造精子”也是單倍體細(xì)胞(1N)，更準(zhǔn)確地說，“人造精子”的實(shí)質(zhì)其實(shí)就是單倍體胚胎干細(xì)胞(1N)。單倍體胚胎干細(xì)胞也是胚胎干細(xì)胞的一種，相對于正常二倍體的胚胎干細(xì)胞(2N)，其核內(nèi)只包含一套完整的遺傳物質(zhì)，細(xì)胞也較二倍體干細(xì)胞小(小鼠單倍體細(xì)胞直徑8 μm左右，二倍體細(xì)胞大約為10 μm)[4-5]。對單倍體來說，如果基因發(fā)生突變，沒有備份基因來補(bǔ)償其功能的缺失，因此會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的生理缺陷，生物學(xué)家也就可以得知這個(gè)基因是與這一生理缺陷相關(guān)。相比于正常成熟的精子來說，“人造精子”不僅僅保持了精子的單倍體性，而且也可以作為另一半遺傳物質(zhì)的提供者，與卵細(xì)胞結(jié)合，產(chǎn)生健康的后代[6-8]。更重要的是，“人造精子”具有胚胎干細(xì)胞的全能性，保持了在體內(nèi)或者體外的三胚層分化能力，也就是說具有在一定的條件下發(fā)育成完整的生物個(gè)體的能力，以及作為干細(xì)胞能夠通過細(xì)胞分裂來擴(kuò)增的能力，能夠長期傳代培養(yǎng)[9]。然而精子在成熟后，就再也不能進(jìn)行分裂擴(kuò)增了，只有當(dāng)與卵細(xì)胞結(jié)合成為合子后，才能以二倍體的形式繼續(xù)分裂發(fā)育下去。

目前，從“人造精子”建立的來源來說，主要分為兩類：一類是父源的單倍體胚胎干細(xì)胞，主要使用精子的細(xì)胞核構(gòu)建的單倍體胚胎干細(xì)胞系；一類是母源的單倍體干細(xì)胞，使用的是卵細(xì)胞的細(xì)胞核構(gòu)建單倍體胚胎干細(xì)胞系[10]。無論是父源還是母源的單倍體干細(xì)胞系，目前構(gòu)建成功的細(xì)胞系，其細(xì)胞核內(nèi)包含的性染色體全部都是X染色體，而無包含Y染色體的單倍體干細(xì)胞系[6-7]。這也就說明，Y染色體本身可能無法支持單倍體干細(xì)胞的各種生理活動(dòng)，使其無法成活，也可能是目前的技術(shù)有限，不能提供Y染色體單倍體干細(xì)胞的生存環(huán)境。所以，通過注射“人造精子”(X)到卵細(xì)胞(X)中得到的幼仔均是雌性(X+X=XX)。

單倍體胚胎干細(xì)胞的一個(gè)特點(diǎn)就是，在培養(yǎng)過程中會(huì)自發(fā)的二倍體化，也就是會(huì)有一部分單倍體細(xì)胞會(huì)成為二倍體細(xì)胞。小鼠細(xì)胞體外分化單倍性維持很不穩(wěn)定，而人的相對穩(wěn)定[11-12]。這對單倍體的應(yīng)用帶來極大的不便，因?yàn)槲覀儽仨毑粩嗟馗患瘑伪扼w干細(xì)胞，才能保證其基因組的單倍體性。目前的研究表明，造成二倍體化的原因主要是由于單倍體干細(xì)胞的細(xì)胞分裂過程不能正常完成導(dǎo)致的，而不是兩個(gè)單倍體細(xì)胞發(fā)生融合產(chǎn)生的。正常二倍體細(xì)胞的有絲分裂過程分為分裂間期和分裂期(M期)；分裂間期又被分為G1期(合成細(xì)胞分裂所需要的蛋白，為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備)、S期(細(xì)胞核內(nèi)染色體DNA的復(fù)制)和G2期(細(xì)胞生長，蛋白合成，為分裂期做準(zhǔn)備)。然而，有一部分的單倍體細(xì)胞在分裂期時(shí)發(fā)生異常，如跳過M期和重新進(jìn)入G1/S期，導(dǎo)致DNA含量加倍而未進(jìn)行分裂。因此，使用一種含有Wee 1激酶小分子抑制劑的改良培養(yǎng)基，通過加速單倍體胚胎干細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)變和防止再進(jìn)入額外的G1/S期，以此來調(diào)節(jié)單倍體胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞分裂周期，發(fā)現(xiàn)該方法可用于單倍體胚胎干細(xì)胞的體外較長期維持[13]。浙江大學(xué)的沈立教授研究組也發(fā)現(xiàn)，通過在2i培養(yǎng)基中加入藥物PD166285，用于加速S-G2/M期的轉(zhuǎn)換，也可以使得單倍體胚胎干細(xì)胞維持其單倍體性5周以上[14]。這些結(jié)果支持了細(xì)胞周期異常是單倍體細(xì)胞自二倍體化的原因，說明單倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞在細(xì)胞周期調(diào)控上存在差異。

目前來說，常規(guī)性的單倍體胚胎干細(xì)胞維持需要流式細(xì)胞儀來進(jìn)行單倍體的分選和富集[4-5]，也可以根據(jù)單倍體與二倍體細(xì)胞的大小，選擇合適孔徑的濾膜將單倍體細(xì)胞過濾出來[15-16]。流式細(xì)胞儀是用來分選細(xì)胞的大型儀器，其工作原理大致是靠其靈敏的光學(xué)探測器，來捕捉細(xì)胞被特定的激光照射后所散射的熒光，這些光信號(hào)又被轉(zhuǎn)換成為電信號(hào)，進(jìn)一步轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)才能進(jìn)行分析。細(xì)胞內(nèi)的DNA可以被一種藍(lán)色熒光染料Hoechst 33342結(jié)合，使得細(xì)胞核在波長355 nm的激光照射下發(fā)出波長約461 nm的熒光[17-18]。當(dāng)染色后的單倍體胚胎干細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀時(shí)，其散發(fā)的熒光會(huì)被捕捉到。單倍體只含有二倍體一半的DNA，因此單倍體胚胎干細(xì)胞所發(fā)出的熒光強(qiáng)度也比二倍體細(xì)胞小。正因?yàn)槿绱耍覀兛梢栽诹魇郊?xì)胞儀的分析統(tǒng)計(jì)界面看到細(xì)胞的熒光強(qiáng)度主要集中為3個(gè)峰：熒光強(qiáng)度最小的峰a是單倍體細(xì)胞所散發(fā)的，峰b是二倍體細(xì)胞及處于細(xì)胞周期G2期到M期的單倍體細(xì)胞，峰c是四倍體細(xì)胞，也即處于細(xì)胞周期G2期到M期的二倍體細(xì)胞[19]。選擇峰a處的細(xì)胞，便可將單倍體胚胎干細(xì)胞分離出來(圖2)。

3 “人造精子”的起源和建立

在早期的研究中，由于酵母可以產(chǎn)生單倍體的孢子，其為單一基因功能的闡釋提供了很好的工具。同時(shí)，酵母的單倍體的孢子也可以被用來進(jìn)行大規(guī)模的篩選某一信號(hào)相應(yīng)通路中各種組分，極大地推動(dòng)了對未知基因的研究[20]。相比于酵母孢子這種天然的單倍體，高等動(dòng)物很難獲得狀態(tài)很好的單倍體細(xì)胞。自從1970年以來，生物學(xué)家投入了大量精力來獲得小鼠的單倍體胚胎[21]。1981年，小鼠的二倍體胚胎干細(xì)胞系構(gòu)建成功，因此，生物學(xué)家按照同樣的思路來構(gòu)建小鼠的單倍體胚胎干細(xì)胞系[22-23]。激活減數(shù)分裂II期的卵母細(xì)胞的確得到了單倍體的胚胎，但是利用這些胚胎構(gòu)建的細(xì)胞系都是二倍體的細(xì)胞系。后來發(fā)現(xiàn)，這一過程是由于單倍體干細(xì)胞在培養(yǎng)過程中很快發(fā)生二倍體化。將近30年過去了，單倍體胚胎干細(xì)胞的建立一直沒有突破，這也限制了單倍體胚胎干細(xì)胞在高等動(dòng)物研究中的應(yīng)用。最早報(bào)道的一株類單倍體的高等哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系為KBM7。它是從人的白血病細(xì)胞系中分離得到的，是一株癌癥細(xì)胞系，除了8號(hào)染色體是兩條外，其余的常染色體均為單倍體，但是由于其來源是腫瘤細(xì)胞，基因組的不穩(wěn)定性也使其不能更廣泛地被接受[24]。

圖2 流式細(xì)胞儀和單倍體的分選富集。左圖是用于分選單倍體胚胎干細(xì)胞的大型流式細(xì)胞儀；右圖是單倍體胚胎干細(xì)胞系經(jīng)過流式細(xì)胞儀的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，分為a、b和c三個(gè)峰，所要分選的單倍體胚胎干細(xì)胞為a峰

真正意義上的脊椎動(dòng)物單倍體胚胎干細(xì)胞的建立是在2009年，新加坡國立大學(xué)Yi等人建立了青鳉魚的雌核發(fā)育的單倍體胚胎，進(jìn)而衍生出了三株單倍體胚胎干細(xì)胞系，在傳代中十分穩(wěn)定地存在，并且還能夠代替青鳉魚的精子，具有受精的能力[8](圖3(a-d))。緊接著在2011年，英國科學(xué)家Wutz實(shí)驗(yàn)室和奧地利科學(xué)家Penniger實(shí)驗(yàn)室同時(shí)報(bào)道了高等哺乳動(dòng)物小鼠孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立，這是在體外首次建立的高等哺乳動(dòng)物正常的單倍體細(xì)胞系[4-5]。2012年，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所李勁松實(shí)驗(yàn)室和中國科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪老師實(shí)驗(yàn)室，先后報(bào)道了小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立[6-7](圖3(e))。

圖3 半克隆青鳉魚和半克隆小鼠。(a)半克隆青鳉魚表現(xiàn)出類似于母親的色素積累，(b、c)與單倍體胚胎干細(xì)胞一樣，也表達(dá)綠色熒光蛋白，(d)半克隆青鳉魚可以正常地產(chǎn)出后代；(e)小鼠的單倍體胚胎干細(xì)胞通過胞漿內(nèi)孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞注射(ICAHCI)得到的半克隆小鼠

目前，小鼠孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系的建立主要是通過激活沒有受精的卵母細(xì)胞，待其發(fā)育到囊胚期，分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，并用2i ESCs培養(yǎng)體系的培基培養(yǎng)，一定時(shí)間后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行單倍體細(xì)胞的分選，將分選得到的單倍體細(xì)胞繼續(xù)生長，重復(fù)此過程，最終得到的單倍體穩(wěn)定的孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系[4-5]。另一種方法是，在剛受精后的合子雄原核和雌原核融合前，把雄原核取出來，然后培養(yǎng)成囊胚來構(gòu)建孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系。上述方法，如果將雌原核取出來，構(gòu)建出來的就是孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系[25-26]。孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系還可以通過將精子的頭部注入去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，體外培養(yǎng)成囊胚來構(gòu)建[6-7](圖4)。

圖4 小鼠孤雌和孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞的構(gòu)建方法。孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞靠激活減數(shù)分裂二期中期的卵母細(xì)胞或者去除受精卵中的雄原核的方法獲得；孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞通過去除受精卵中的雌原核，或者激活注入精子頭的去核卵細(xì)胞的方法獲得。得到的孤雌和孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞都要靠流式細(xì)胞儀來分選富集

這些構(gòu)建好的小鼠孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞系均沒有受精能力，注射至成熟的卵細(xì)胞中，不能得到存活的后代，因此在個(gè)體水平上利用孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞獲得基因修飾的動(dòng)物難度非常大，制約了其應(yīng)用。相比之下，小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞系具有一定的受精能力。李勁松實(shí)驗(yàn)室通過注射孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞到卵母細(xì)胞后，激活并啟動(dòng)胚胎發(fā)育，成功得到了健康的小鼠(ICAHCI技術(shù))[6]。因?yàn)檫@些小鼠只有一半遺傳物質(zhì)來自同樣的父本，所以也稱之為半克隆小鼠。但是，運(yùn)用這種技術(shù)得到小鼠的效率很低，最好的也僅有5%，而且有一半是發(fā)育異常的小鼠；并且隨著單倍體細(xì)胞生長的時(shí)間加長，有逐漸丟失這種“受精”能力的跡象，以至于最終不能獲得存活的半克隆小鼠。

如何才能提高小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞注射的成功率和獲得健康小鼠的效率，是擺在生物學(xué)家面前的難題，也是技術(shù)能否進(jìn)一步得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。經(jīng)過努力，研究人員發(fā)現(xiàn)小鼠孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞的表觀基因組與正常的精細(xì)胞有很大差別，這可能是制約半克隆小鼠成功獲得的關(guān)鍵之一。表觀基因組學(xué)是對非DNA突變帶來的可遺傳性變化的研究，這些變化可來自外界環(huán)境因素或者生物體自身的發(fā)育過程。DNA的甲基化修飾是表觀基因組學(xué)的一個(gè)重要修飾形式，細(xì)胞核內(nèi)的DNA在某些條件下可以被DNA甲基化酶甲基化修飾，從而影響此處的基因發(fā)揮作用。小鼠單倍體胚胎干細(xì)胞在H19和IG兩個(gè)基因的差異甲基化區(qū)域的DNA甲基化水平要低于精子的DNA甲基化水平，隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間增長，這兩個(gè)區(qū)域甲基化逐漸變少，并且健康狀態(tài)的小鼠DNA甲基化明顯高于死亡小鼠。這些現(xiàn)象表明，小鼠單倍體胚胎干細(xì)胞的表觀基因組對半克隆小鼠的狀態(tài)有很大影響。依此原理，李勁松實(shí)驗(yàn)室通過改變H19和IG兩個(gè)基因的差異甲基化區(qū)域，成功地提高了半克隆小鼠的成活率，從5%提高到20%[27]。而且，不僅僅是孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞，修改過后的孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞也可以有效地產(chǎn)生半克隆小鼠，效率約15%。這些研究極大地推動(dòng)了單倍體干細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值，使得單倍體的研究從細(xì)胞層面上升到個(gè)體層面，提高了研究的準(zhǔn)確度和可靠度。

4 人造精子的應(yīng)用價(jià)值

隨著“人造精子”——單倍體胚胎干細(xì)胞近年來在技術(shù)上的不斷突破，以及CRISPR基因定點(diǎn)編輯技術(shù)的興起，二者可以完美融合在一起，使生命科學(xué)的研究發(fā)生了翻天覆地的變化。下面就來講述一下“人造精子”在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮的重要作用。

4.1 生命科學(xué)研究

“人造精子” 由于其基因組的單倍體性，且在體外幾乎能夠無限擴(kuò)增和擁有多組織分化潛能的特性，被廣泛地應(yīng)用到各種基因的功能研究中[28]，如干細(xì)胞的分裂與分化原理、性染色體相互作用、基因印記功能等。首先，“人造精子”本身就是一個(gè)很有科學(xué)意義的研究，包括其在生長發(fā)育過程中與二倍體之間的差異，其在培養(yǎng)過程中如何保持表觀基因組，如何才能進(jìn)一步地提高半克隆小鼠的生存率等。其次，近年來基因編輯技術(shù)的興起，ZFN、TALEN和CRISPR的進(jìn)步，使科研人員可以輕而易舉地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平的基因編輯，也可以通過在受精卵中注射所需要的組分直接得到基因編輯過的小鼠個(gè)體[29]。然而，在對受精卵編輯的過程中，一次性得到多個(gè)基因編輯的動(dòng)物模型構(gòu)建比較困難，且由于基因編輯效率的不同，出生的小鼠帶有基因編輯的類型也各不相同?！叭嗽炀印痹诩?xì)胞層面的可操作性強(qiáng)，可以支持任意的基因編輯方式，更可同時(shí)編輯多個(gè)目的基因，通過ICAHCI技術(shù)可以一步轉(zhuǎn)化成小鼠模型，相比于在受精卵中進(jìn)行編輯大大提高了效率，節(jié)省了構(gòu)建時(shí)間和研究經(jīng)費(fèi)。

除了單個(gè)或多個(gè)基因的功能研究，單倍體胚胎干細(xì)胞更大的優(yōu)勢是在全基因組的大規(guī)模篩選上。CRISPR技術(shù)利用特定靶向基因組上某個(gè)特定位置進(jìn)行編輯，其組分中的sgRNA決定著編輯的位置，通過構(gòu)建靶向某一類基因家族，可以研究某一類基因家族的生理功能，更可以構(gòu)建靶向基因組所有基因的sgRNA文庫，進(jìn)一步轉(zhuǎn)入單倍體胚胎干細(xì)胞中，得到具有每一個(gè)基因都被編輯的單倍體胚胎干細(xì)胞突變體庫[30-31]。再利用這一單倍體細(xì)胞突變庫進(jìn)行對藥物的篩選，或其他條件性的篩選，得到的目標(biāo)細(xì)胞可以用來進(jìn)一步研究基因功能，也可以方便地建立模型小鼠庫；再利用小鼠庫進(jìn)行動(dòng)物水平的篩選或研究，使篩選和研究的結(jié)果更加方便和可靠。單倍體胚胎干細(xì)胞使得細(xì)胞水平的研究和動(dòng)物個(gè)體水平的研究形成統(tǒng)一，為生命科學(xué)的各項(xiàng)研究提供了一個(gè)連續(xù)不間斷的新體系，有望成為基因研究的新標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 遺傳病的控制

人類的基因組計(jì)劃在2003年4月完成，一共46條染色體包含了近30億對堿基。其中有大約20 500個(gè)蛋白編碼基因，只占了堿基總數(shù)的5 %，剩余的堿基序列，除了部分已知的增強(qiáng)子、非編碼RNA等，大部分的功能目前還不是很清楚。在細(xì)胞分裂的過程中，基因組也會(huì)發(fā)生復(fù)制。雖然有很嚴(yán)格的修復(fù)機(jī)制，使得復(fù)制的錯(cuò)誤率很低，但還是會(huì)不可避免地發(fā)生某些錯(cuò)誤，尤其是會(huì)導(dǎo)致基因組中重要基因突變的錯(cuò)誤，進(jìn)而產(chǎn)生了基因功能發(fā)生變化帶來的生理缺陷病。如果生理缺陷病是可遺傳的，則稱為遺傳性疾病，通常為患者的精子或卵細(xì)胞攜帶突變造成的。因此，要徹底解決這些遺傳性疾病就必須修復(fù)患者的基因組信息，使得突變位點(diǎn)不會(huì)再遺傳到子代中去。另外，利用“人造精子”可以成功修復(fù)個(gè)體的遺傳性疾病，不僅對單基因的遺傳病有效，對多基因遺傳病的同時(shí)修復(fù)更是其他技術(shù)所不能達(dá)到的，在未來遺傳病的控制中發(fā)揮著不可比擬的作用。

4.3 GTP計(jì)劃和蛋白質(zhì)云圖

在完成了利用“人造精子”對單個(gè)或者幾個(gè)基因的編輯，成功地徹底修復(fù)了遺傳性疾病之后，研究人員并沒有停止，而是把目光轉(zhuǎn)向了“人造精子”在整個(gè)基因組基因研究中的應(yīng)用。在基因組修復(fù)的過程中，研究人員使用了健康的序列，讓DNA在復(fù)制的過程中按照健康的序列進(jìn)行復(fù)制，因此在子代的細(xì)胞中就會(huì)出現(xiàn)帶有健康序列的單倍體胚胎干細(xì)胞。如果在提供的序列上加上一些特定的標(biāo)記，那么這些標(biāo)記也會(huì)被加到基因組中。如果標(biāo)記在一個(gè)可翻譯蛋白質(zhì)上，那么我們就可以通過檢測這個(gè)標(biāo)記來檢測這個(gè)蛋白，就比如你的玻璃球用彩筆做個(gè)標(biāo)記，然后再和別人的混起來，這樣你就能很輕松地根據(jù)標(biāo)記把你的玻璃球與別人的分開。同樣的道理，可以在感興趣的基因后面加一個(gè)標(biāo)記，這樣就可以檢測該基因在細(xì)胞中的位置，表達(dá)量的多少，在某些條件下有沒有發(fā)生變化等信息。這種檢測的結(jié)果十分可靠，可以直接檢測通過ICAHCI技術(shù)出生的健康子代中該基因的真實(shí)表達(dá)量，這一點(diǎn)是其他常規(guī)技術(shù)所不能辦到的。如果采用一種標(biāo)準(zhǔn)的HA序列標(biāo)記，就可以用一種HA的抗體來檢測所有的目標(biāo)蛋白，可避免傳統(tǒng)方法中要制備各種不同抗體的困難和抗體的效價(jià)不穩(wěn)定的弊端，節(jié)約大量研究成本和時(shí)間。因此，在2017年5月份，由李勁松研究員率先提出了基因組標(biāo)簽計(jì)劃(Genome Tagging Project，GTP)，計(jì)劃對小鼠2萬左右個(gè)基因全部完成標(biāo)簽加入，構(gòu)建帶有標(biāo)簽的細(xì)胞系及小鼠模型，并為中國和整個(gè)世界提供整個(gè)資源庫。計(jì)劃一提出便得到了來自各個(gè)研究者和研究機(jī)構(gòu)的支持，分別表示了對該計(jì)劃的設(shè)想。目前，該計(jì)劃正在進(jìn)行中，第一批的資源將會(huì)在2019年6月份開放給研究者。

在GTP計(jì)劃的基礎(chǔ)之上，李勁松研究員又提出了全基因組蛋白質(zhì)云圖(Protein Atlas)的設(shè)想。通過GTP產(chǎn)生的細(xì)胞系及小鼠模型，研究者來構(gòu)建全方位、不同發(fā)育時(shí)期、不同生長條件下的蛋白質(zhì)實(shí)時(shí)示蹤和捕捉，為了解生命活動(dòng)的各項(xiàng)調(diào)節(jié)過程提供最為準(zhǔn)確的信息。通過將不同的示蹤方法、不同的檢測體系、不同的信號(hào)通路混合起來同在一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)進(jìn)行觀察和研究，研究人員將會(huì)繪制一幅漂亮的蛋白全景云圖。

5 展望

“人造精子”在不同研究層面都展現(xiàn)了優(yōu)秀的品質(zhì)，而且隨著生命科學(xué)技術(shù)的更新，“人造精子”的應(yīng)用也更加廣泛。未來“人造精子”的研究將會(huì)主要圍繞在其單倍體穩(wěn)定性的研究、表觀基因組的維持和改善、“人造精子”向成熟精子的轉(zhuǎn)變、提高健康動(dòng)物模型的出生效率及蛋白質(zhì)云圖等方面?！叭嗽炀印奔夹g(shù)的繼續(xù)高速發(fā)展，需要生物學(xué)家不懈的努力。

(2018年6月8日收稿)■