超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肝臟中的馬杜霉素

□ 孫轉(zhuǎn)蓮 祝偉霞 張 丹 馮景菲 河南檢驗檢疫鑒定咨詢中心

馬杜霉素（Maduramicin），又名馬度米星，屬于聚醚類抗生素，是用藥劑量最小的聚醚類抗球蟲藥，常用于肉雞球蟲病。聚醚類離子抗生素在動物體內(nèi)分布廣泛，絕大部分藥物及其代謝產(chǎn)物經(jīng)膽管排出體外，其中，肝臟和脂肪殘留物濃度最高，其次為腎臟、雞肉和血漿［1］。殘留在雞肝臟中的藥物，為食品安全帶來不安全因素。攝入殘留有馬杜霉素的食物會引起人血管舒張，特別誘發(fā)心臟冠狀動脈擴張和血流量增加?，F(xiàn)有的方法主要針對組織（豬肉、雞肉、牛肉等）中馬杜霉素的檢測，對于肝臟中的馬杜霉素的檢測文獻報道較少。本文建立了以乙腈提取，經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測的分析方法，解決了雞肝臟基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)較大，靈敏度低的問題。根據(jù)《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定馬杜霉素在雞肝臟中的最高殘留限量為720 μg/kg［2］，本方法可滿足要求。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器及試劑

材料：市售雞肝臟。

儀器：三重四極桿串聯(lián)液相色譜-質(zhì)譜儀（API 5500Q，美國應(yīng)用生物公司，包括Waters classⅠ液相色譜儀；電子天平（AB265-S，梅特勒·托利多，瑞士）；電子天平（xp-204，梅特勒·托利多，瑞士）；組織絞碎機；振蕩器；低速離心機；氮吹儀；超聲波清洗器。

試劑：乙腈（99%，默克，色譜純）；甲醇（99%，默克，色譜純）；HLB柱（Waters，3cc/60mg）；馬杜霉素（Dr.Ehrenstorfer GmbH； ≥ 91.0%）；去離子水。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

稱取5.00g（精確至0.01g）試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL乙腈提取，渦旋5 min，超聲10 min，4000 r/min離心10 min，取上清液，在殘渣加入10 mL乙腈重復(fù)提取一遍，合并上清液，于45℃水浴中氮氣吹干，用30%甲醇/水溶解殘渣，待凈化。將溶解液過HLB柱，用30%甲醇/水淋洗，負壓下抽干。用3mL甲醇洗脫，于45℃水浴中氮氣吹干，用1mL甲醇水（v+v,7+3）溶解殘渣，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.2 馬杜霉素測定

以外標法定量。取峰面積為縱坐標，溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線，用工作曲線對樣品進行定量。馬杜霉素總離子流圖及提取離子流圖如圖1、圖2所示。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18， 1.7μm；2.1mm×50mm。流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液，由1.5 min 40 %甲醇到90 %甲醇，保持3.5min，回到初始位置。流速：0.3 mL/min。柱溫：30℃。進樣量為 10 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜采用電噴霧離子源、正離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）檢測方式：霧化氣 50 psi；氣簾氣25psi；輔助加熱氣60 psi；噴撞氣Medium；輔助加熱氣溫度550℃； 噴霧電壓5500V； 出口池電位CXP，12V。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

將標準溶液依次從低濃度到高濃度進樣，按其所得到的峰面積和對應(yīng)的標準溶液質(zhì)量濃度（ng/mL）做工作曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。試驗在2～200 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，回歸方程為y=1.18e+003x+3.92e+003，相關(guān)系數(shù)r=0.9983，滿足分析要求。

圖1 馬杜霉素總離子流圖

圖2 馬杜霉素提取離子流圖

2.2 色譜條件的確定

試驗分別以甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相比較，以ACQUITY UPLC BEH C18，1.7μm，2.1mm×50mm柱 和ACQUITY UPLC HSS T3，1.8 μm，2.1 mm×10 mm 液相色譜柱為對比，得到色譜條件：以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相，使用BEH柱，流速為0.3 mL/min；柱溫30℃；進樣量為10 μL,得到的色譜峰形良好，峰型尖銳，且無拖尾現(xiàn)象。

2.3 質(zhì)譜條件的確定

馬杜霉素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，通過含有若干環(huán)狀醚鍵，分子一端有一羧基，分子兩端借助氫鍵相連而生成環(huán)狀結(jié)構(gòu)后，容易與Na+、K+等離子結(jié)合生成親脂性絡(luò)合物[3]。試驗中100 ng/mL的標準溶液，在ESI+模式下進行母離子全掃描，未出現(xiàn)m/z 為[M+1]+的分子離子峰，得到的是[M+23]+處的離子峰很強，優(yōu)化準分子離子（[M+23]+）的去簇電壓和碰撞能量，選擇得到兩個信號強度較大的碎片離子作為特征離子，最后以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）的模式優(yōu)化各種參數(shù)。具體參數(shù)見表1。

2.4 回收率與精密度試驗

取5份空白雞肝臟樣本，按照樣品前處理得到空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液配制標準曲線進行回收率和精密度的試驗，結(jié)果表明：馬杜霉素3個質(zhì)量濃度的添加水平（2.0、5.0、10.0 μg/kg）6個平行樣品的回收率在78.5%～108.6%，批內(nèi)變異系數(shù)均小于12.3%，具體參數(shù)見表2。

表1 定性離子對和定量離子對

表2 雞肝臟中添加3個水平的回收率和變異系數(shù)

2.5 檢測限的確定

樣品添加濃度為1.0 μg/kg,馬杜霉素的信噪比S/N＞3（按峰對峰計），表明方法的檢測限可定為1.0 μg/kg。定量限的確定：添加濃度為2.0 μg/kg，馬杜霉素的信噪比S/N＞10（按峰對峰計），表明方法的定量限可定為 2.0 μg/kg。

3 結(jié)論

本文采用乙腈提取，HLB柱凈化，UPLC分離，建立了雞肝臟中馬杜霉素殘留的檢測。在進行樣品前處理的過程中，使用不同比例的定容液，樣品回收率差異較為顯著，使用高比例的有機相定容時樣品溶解較完全，樣品回收率穩(wěn)定。整個實驗過程簡單、快速，比較適合大量雞肝臟樣品中馬杜霉素的檢測。