UPLC-MS法測定減肥茶中的咖啡因

□ 李澤夏瓊 貴州省食品藥品檢驗(yàn)所 石春梅 貴州醫(yī)科大學(xué)神奇民族醫(yī)藥學(xué)院

現(xiàn)如今，隨著人們的生活水平不斷提高，肥胖癥成為一種普遍的慢性健康疾病，一直威脅著全球人類的健康。隨著科學(xué)家對于肥胖癥的機(jī)理及減肥藥藥物的不斷研究[1]，各種不同原理、不同形態(tài)、不同使用方法的減肥類保健食品也相繼登上了市場，在這其中，減肥茶由于其明顯的效果、方便的使用方法以及獨(dú)特的口感，成綠色健康減肥的主潮流中的寵兒[2]。市面上的減肥茶的主要成分包括：茶葉、荷葉、番瀉葉、決明子、絞股藍(lán)等[3]。

咖啡因是茶葉中主要功效成分之一，能夠通過加快脂肪的氧化、提高能量的消耗速度并且有適當(dāng)降低食欲的效果。然而，長期大量服用咖啡因不僅會對容易對敏感的消費(fèi)者產(chǎn)生失眠、興奮、耳鳴、躁動不安等不良作用[4]，對于一般消費(fèi)者也有許多不良影響，嚴(yán)重的甚至可以導(dǎo)致肌肉震頗和心跳過速[5]。有研究表明過量攝入咖啡因會對妊娠婦女產(chǎn)生多種不良影響，造成胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、早產(chǎn)、先天畸形等[6]。因此，根據(jù)加拿大衛(wèi)生部發(fā)布建議，健康成人每天咖啡因的安全攝入量僅為400 mg，未成年人和孕婦的安全攝入量更小[7]。

國家食品藥品監(jiān)管局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件（2006004、2012005）以及《食藥監(jiān)辦許[2010]114號及附件中將咖啡因作為減肥類保健食品中的非法添加物質(zhì)，但對于減肥茶中的咖啡因含量未進(jìn)行檢驗(yàn)和規(guī)定。因此，建立超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定咖啡因含量可以為減肥茶的質(zhì)量控制提供依據(jù)，并對其安全性和有效性進(jìn)行了保證。本文建立了減肥茶中咖啡因含量測定的超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀法，進(jìn)行方法學(xué)研究，對碧生源減肥茶中咖啡因含量進(jìn)行測定，此法的前處理簡便、檢測快捷省時(shí)，穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性、專屬性、線性關(guān)系都較良好，能準(zhǔn)確、快速檢測減肥茶中咖啡因含量，對確保減肥茶中咖啡因的含量安全性具有重要意義，也對今后針對減肥茶進(jìn)行的各類研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（XEVO-TQ）、超聲波清洗器（KQ-500DE,昆山市超聲儀器有限公司）、電子天平（XS105DU，MS105DU，德國METTLER TOLEDO公司）。

1.2 試劑試藥

95%乙醇（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）、甲醇（分析純：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；色譜純：美國Tedia公司）、水（去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.3 對照品與樣品

咖啡因?qū)φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院提供，含量100%，批號：171215-201010）；碧生源常青茶（原碧生源牌減肥茶），來源于北京澳特舒爾保健品開發(fā)有限公司，批號：04161204），每100 g含茶多酚1.33 g、總黃酮0.42 g。

2 方法 [4-6]

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取0.010 01 g咖啡因?qū)φ掌罚糜?0 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲數(shù)分鐘使溶解，放冷，用甲醇定容至刻度，該溶液中咖啡因的濃度為1.001 0 μg/mL；再精密吸取上述溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，該溶液中咖啡因的濃度為0.010 01 μg/mL。

2.1.2 供試品溶液的制備

取碧生源減肥茶三包，置于研缽中，混勻，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉0.1 g,至50 mL 量瓶中，加適量乙醇，超聲35 min，待冷卻至室溫，加乙醇定容至刻度線，用力振搖提取。用微孔濾膜（0.22μm）過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 色譜條件及質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件

色 譜 柱： ACQUITY UPLC BEH C18（美國Waters 公司，1.7 μm，2.1×100 mm，柱號02573512515702）。流動相：甲醇-水（20∶80）。流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃。分別精密吸取2.1項(xiàng)下的3種溶液各0.1 μL注入U(xiǎn)PLC-MS，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，記錄色譜峰，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

2.2.2 質(zhì)譜條件

以195.196為母離子，110.038和137.965為子離子，錐孔電壓為32 V，子離子110.038碰撞能量為24 V，子離子137.9645碰撞能量為18 V。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)

精密稱取咖啡因?qū)φ掌?.010 03 g置于10 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取5 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即配制得濃度為0.100 3 μg/mL對照品溶液。在上述設(shè)定好的色譜條件下，精密量取對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5、6 mL于25 mL容量瓶中，分別用甲醇定容至刻度，搖勻，即得線性溶液。將其分別注入U(xiǎn)PLCMS中，進(jìn)樣量0.1 μL，記錄色譜圖，以峰面積A為縱坐標(biāo)，咖啡因的量c（μg）為橫坐標(biāo)，繪制線性回歸曲線，計(jì)算線性方程及相關(guān)系數(shù)r。

2.3.2 儀器精密度試驗(yàn)

精密吸取同一濃度（0.012 036 μg/mL）對照品溶液0.1 μL，在上述設(shè)定好的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄咖啡因?qū)φ掌穲D譜峰面積，計(jì)算6次峰面積值的RSD。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按照2.1.2項(xiàng)下方法，分別處理6份供試品溶液，分別進(jìn)樣0.1 μL，測定峰面積，計(jì)算樣品中咖啡因的含量，并計(jì)算含量平均值。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重復(fù)性試驗(yàn)中的第1份供試品溶液，在上述色譜條件下分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，測定樣品中咖啡因峰面積，計(jì)算6次峰面積值的RSD。

2.3.5 回收率試驗(yàn)

進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)。精密稱取咖啡因?qū)φ掌?.010 03 g置于10 mL容量瓶，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取5 mL置于50 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即配制得濃度為0.100 3 mg/mL對照品溶液。取減肥茶適量，置于研缽中，混勻，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉9份各0.05 g，分別置50 mL量瓶中，其中，第1、2、3份分別精密加入咖啡因回收率對照品溶液1 mL，第4、5、6份分別精密加入咖啡因回收率對照品溶液3 mL、第7、8、9份分別精密加入咖啡因回收率對照品溶液5 mL，9份試樣分別用乙醇定容至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔膜濾過，置進(jìn)樣瓶中，分別注入U(xiǎn)PLC-MS進(jìn)行含量測定，計(jì)算咖啡因回收率。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性

在2.2項(xiàng)所述色譜以及質(zhì)譜條件下，咖啡因出峰時(shí)間適宜，峰型對稱，效應(yīng)值高，并無其他碎片離子干擾?？Х纫?qū)φ掌啡鐖D1所示。根據(jù)靈敏度選擇137.965作為定量離子，110.038作為定性離子。離子分圖（定量離子及定性離子如圖2、圖3所示）。

圖1 咖啡因?qū)φ掌罚傠x子圖）

圖2 咖啡因定量離子

圖3 咖啡因定性離子

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 樣品含量測定結(jié)果

3.2 線性關(guān)系結(jié)果

通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程式為y=25166059x-15186，r=0.99986，其咖啡因在0.000 401 2μg～0.002 407 2 μg內(nèi)范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

3.3 儀器精密度結(jié)果

計(jì)算咖啡因?qū)φ掌菲骄迕娣e為304 648，以及峰面積RSD=0.95%（n=6），表明此方法精密度良好。

3.4 重復(fù)性結(jié)果

結(jié)果樣品含量6次測定值在6.21～6.26 mg/g范圍內(nèi)，樣品平均峰面積為304 280，計(jì)算RSD結(jié)果為0.96%。結(jié)果表明樣品重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性結(jié)果

樣品平均峰面積為313 689.86，RSD為0.68% ，說明在12小時(shí)內(nèi)樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

3.6 回收率結(jié)果

結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)的回收率在101.07%～103.85%，從表1中可以看出，用此方法測定咖啡因含量具有較好的準(zhǔn)確度。

3.7 樣品含量測定結(jié)果

按2.4項(xiàng)中的方法對三批具有減肥功能的碧生源茶類中的咖啡因進(jìn)行含量測定，結(jié)果這三批減肥茶中中咖啡因的含量在6.0～7.3 mg/g范圍內(nèi)。詳見表2。

4 討論

對流動相比例、流速、柱溫進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)表明在流動相比例為甲醇∶水（體積比）=20∶80、流速為0.2 mL/min、柱溫為30 ℃時(shí)，出峰保留時(shí)間適中，峰型較好。此法采用的流速為0.2 mL/min，并且柱壓大小合適，能準(zhǔn)確測定出樣品中咖啡因的含量。若降低流速為0.1 mL/min，則咖啡因的出峰時(shí)間拖后，不利于試驗(yàn)效率。若提高流速為0.3、0.4 mL/min則咖啡因出峰太快的同時(shí)，也降低了檢測咖啡因的靈敏度。這是因?yàn)樵诘土魉傧蚂F化，易于達(dá)到庫倫分裂條件，有利于產(chǎn)生離子，提高信號強(qiáng)度。因此，為保證出峰時(shí)間和試驗(yàn)效率，選擇0.2 mL/min作為最佳的流速選擇。

進(jìn)樣量對于液質(zhì)聯(lián)用儀的影響。進(jìn)樣量是直接影響信號的響應(yīng)，大進(jìn)樣量可以提高靈敏度，但是受色譜柱載樣量的限制，而且對色譜柱以及質(zhì)譜儀的損害較大。所以應(yīng)當(dāng)越小越好。在梯度洗脫時(shí)，可以加大進(jìn)樣量以提高靈敏度。本試驗(yàn)中采用進(jìn)樣量為0.1 μL，在保證靈敏度的同時(shí)，也降低了溶劑效應(yīng)，減輕了對儀器和色譜柱的負(fù)擔(dān)。

本研究采用了超高效液相色譜儀-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS）建立咖啡因含量測定方法并完成方法學(xué)考察并對其進(jìn)行了適用性考察。該方法出峰時(shí)間短，不存在咖啡因與減肥茶中各雜質(zhì)分離的問題，也不需要通過比對光譜來進(jìn)行定性鑒定，可用于各類減肥茶以及含茶類減肥產(chǎn)品中咖啡因的含量測定。