超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定乳蛋白深度水解配方粉中的泛酸

□ 方富良 李 娜 杭州貝因美母嬰營(yíng)養(yǎng)品有限公司

泛酸又稱(chēng)維生素B5、遍多酸，是一種水溶性維生素，幾乎存大于所有活細(xì)胞中。泛酸在酸、堿、光及熱等條件下都不穩(wěn)定。具有制造抗體功能，在維護(hù)頭發(fā)、皮膚及血液健康方面扮演著重要角色。目前，市場(chǎng)上針對(duì)特殊人群的水解蛋乳粉越來(lái)越多，其把完整的大分子蛋白進(jìn)行切割，變成小分子的蛋白甚至游離的氨基酸。采用水解蛋白作為蛋白質(zhì)來(lái)源的奶粉稱(chēng)為水解蛋白奶粉。由于大分子蛋白被水解成小分子，則在目前現(xiàn)有的高效液相色譜法測(cè)試泛酸的過(guò)程，蛋白小分子無(wú)法被鹽沉淀，嚴(yán)重干擾了后續(xù)樣品在液相色譜柱中的分離效果，小分子色譜峰無(wú)法與泛酸目標(biāo)峰很好地進(jìn)行分離。超高效液相色譜-質(zhì)譜法采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)泛酸進(jìn)行檢測(cè)，排除了小分子蛋白帶來(lái)的干擾。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用購(gòu)于市場(chǎng)上售賣(mài)的某品牌乳蛋白深度水解配方粉；乙腈（默克，色譜純）；乙酸（國(guó)藥，GR）；甲酸（SIGMA）；泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（supelco）；同位素內(nèi)標(biāo)泛酸-13C3，15N（維生素B5半鈣鹽）；水系濾膜（津騰，0.22um）。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-MS/MS（WATERS，I-CLASS+TQ-S）；ACQUITY UPLC HSS T3（WATERS，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘儀，H2050R）；萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒，AL204）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，KH3200E）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品（200 μg/mL）配制

稱(chēng)取泛酸鈣21.8 mg,加水溶解至100 mL容量瓶（泛酸鈣換算成泛酸系數(shù)為0.92），冰箱冷藏保存。

泛酸同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）：稱(chēng)取泛酸-13C3，15N 10 mg,加水溶解至100 mL容量瓶，冰箱冷藏保存。

1.3.2 樣品處理

稱(chēng)取樣品約1 g（精確到0.000 1 g）至50 mL棕色容量瓶中，加20 mL 50～60 ℃溫水溶解，加入 1 mL乙酸溶液，超聲提取20 min。取出放置至室溫，加入250 μL同位素內(nèi)標(biāo)溶液，用乙腈定容，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，放入至離心機(jī)以8 000 r/min離心5 min，取出過(guò)濾。用水進(jìn)對(duì)濾液進(jìn)行稀釋200倍，渦旋振蕩，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，供上機(jī)測(cè)試。

1.3.3 測(cè)試條件

色譜柱：WATERS ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。液動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫見(jiàn)表1。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；毛細(xì)管電壓1.5 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣量800 L/h；碰撞氣流速0.14 mL/min。質(zhì)譜監(jiān)測(cè)條件見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證

2.1.1 線性范圍、檢出限和定量限

準(zhǔn)確吸取泛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別添加泛酸同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋成濃度為0.5～10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以峰面積比和同位素濃度的乘積為縱從標(biāo)、泛酸標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫從標(biāo)，繪投影標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，泛酸在0.5～10 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。線性回歸方程為y=1.44389x+1.14868，相關(guān)系數(shù)r=0.99916。根據(jù)儀器的檢出限（定量離子S/N=3）及定量下（定量離子S/N=10），結(jié)合樣品的前處理過(guò)程，計(jì)算得到方法檢出限為方法定量限，分別為0.02 mg/100 g和0.08 mg/100 g。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

表2 質(zhì)譜監(jiān)測(cè)條件

表3 泛酸加標(biāo)回收測(cè)試結(jié)果

2.1.2 回收率

取乳蛋白深度水解配方粉，進(jìn)行3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)添加水平的回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，分別計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3。泛酸3個(gè)水平的加標(biāo)回收率在91.3%～103.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.1%～3.5%，能夠滿足檢測(cè)實(shí)際品的要求。

3 分析結(jié)論

（1）由于樣品添加水解蛋白，無(wú)法簡(jiǎn)單地用酸很好沉淀，本方法運(yùn)用乙腈沉淀，使樣液能很好地離心過(guò)濾。

（2）相對(duì)高效液相色譜法采用質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式排除了蛋白小分子對(duì)泛酸目標(biāo)峰的干擾。

（3）樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)單，較大的縮短了儀器測(cè)試時(shí)間，提高效率。