山梨酸鹽與鈣脅迫對甜櫻桃灰霉病抗性的誘導(dǎo)作用

徐樂藝，張麗媛，郭宇歡，顏佳薇，陳紅梅，何緒生，何 玲*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

甜櫻桃（Prunus avium）采收于鮮果淡季，因其風味香甜可口而深受消費者的青睞。此外，果肉中含鐵量比蘋果高20～30 倍，加之富含褪黑素[1]、維生素、花青素等抗氧化生物素，有“水果中的鉆石”的美譽。但甜櫻桃皮薄肉軟，采收正值高溫高濕季節(jié)，在貯運過程中極易受致病性微生物侵染而滋生病害導(dǎo)致褐變與腐爛。灰霉病是甜櫻桃采后常見的侵染性病害之一，其病原菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）具有低溫致病的優(yōu)勢，在低溫貯運中發(fā)病率仍然較高[2]。研究表明，灰霉病與果實中鈣含量密切相關(guān)，鈣處理能夠激活果實自身的防御系統(tǒng)及固有的抗菌物質(zhì)活性，誘導(dǎo)果實產(chǎn)生抗性，降低和抑制病原菌的侵染[3-5]。山梨酸是國際公認的高效、綠色、安全的防腐劑[6]，其鉀鹽山梨酸鉀易溶于水，具有廣譜的抑菌效果，對霉菌及好氧性細菌均有效強的抑制作用[7]。目前已有報道山梨酸鉀對蘋果[8]、葡萄[9]、柑橘[10]等果實的多種病害具有良好的誘導(dǎo)抗性效果，但對櫻桃灰霉病的抑制效果卻鮮有報道。

本實驗通過離體實驗篩選出山梨酸鉀及CaCl2處理的最佳質(zhì)量濃度，再將采前噴鈣和采后山梨酸鉀處理相結(jié)合，探討該處理誘導(dǎo)櫻桃果實對灰霉菌產(chǎn)生抗性的效果，為甜櫻桃貯運保鮮提供新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘秦櫻1號’甜櫻桃于2016年5月18日采收于西北農(nóng)林科技大學(xué)銅川櫻桃實驗站。采收時盡量保持色澤、大小一致，且無明顯機械損傷及病蟲害，裝在聚乙烯（polyethylene，PE）包裝袋（厚度0.03 mm）放入塑料箱中運回冷庫，在（0±1）℃條件下預(yù)冷24 h后備用。

灰葡萄孢霉購自西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院。

山梨酸鉀、CaCl2、葡萄糖、瓊脂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、次氯酸鈉、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫等均為國產(chǎn)分析純，購買于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BD-11D型冰箱 安徽中科都菱公司；HHW-21CU-600型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY公司；DC1212型高速冷凍離心機 北京時代北利離心機有限公司；UV2002型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器公司；LR250恒溫生化培養(yǎng)箱 上海軋艮儀器設(shè)備有限公司；WCLL-230BE電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；電子數(shù)顯游標卡尺 桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司；JSM-6360LV掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州蘇凈有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸浮液的制備

灰霉菌在23 ℃ PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后挑取灰霉菌孢子，加入無菌水充分攪拌后過濾。在紅血球計數(shù)板上調(diào)整菌懸液的孢子濃度達到1×106spores/mL。

1.3.2 實驗處理

1.3.2.1 離體實驗

將PDA經(jīng)滅菌后冷卻至45 ℃左右，加入一定比例的藥劑混勻，制成CaCl2質(zhì)量濃度為5、10、15、20 g/L及山梨酸鉀質(zhì)量濃度為1、3、5、7 g/L的平板，以不加入任何藥劑為對照處理（CK組）。每組處理重復(fù)3 次，平板凝固后，用滅菌打孔器在中央打孔（直徑6.0 mm）并滴入20 μL菌懸液，在23 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天測定一組數(shù)據(jù)，直至CK組菌落長滿培養(yǎng)皿。

用上述離體實驗篩選出最佳質(zhì)量濃度的CaCl2與山梨酸鉀及二者復(fù)合處理制成平板，以不添加藥劑的PDA培養(yǎng)基為對照（CK組），取20 μL孢子懸浮液滴在無菌載玻片中央，凝固后滴入10 μL菌懸液，蓋上蓋玻片后于23 ℃下培養(yǎng)，每組處理重復(fù)3 次。每天用掃描電子顯微鏡觀察灰霉菌芽管生長及分生孢子的萌發(fā)情況，拍照并記錄。

1.3.2.2 活體接種實驗

先用體積分數(shù)2%次氯酸鈉浸泡甜櫻桃果實2 min，無菌水沖洗3 次后晾干。實驗分為4 組處理：對照組（未處理，CK組）、CaCl2處理組（采前噴20 g/L CaCl2）、山梨酸鉀處理組（僅采后5 g/L山梨酸鉀浸泡2 min）、CaCl2+山梨酸鉀處理組（采前20 g/L CaCl2處理，采后5 g/L山梨酸鉀浸泡2 min）。用滅菌的牙簽在甜櫻桃果面刺3 mm的傷口，傷口表面晾干后，滴入10 μL無菌水。24 h后，在傷口處滴入10 μL灰霉孢子懸浮液，放置于室溫（23±1）℃下。每天測定一次數(shù)據(jù)，直至病菌布滿果面，取病斑周圍的果肉留樣待測相關(guān)酶活力指標。每組處理放置20 個果實，設(shè)置3 個重復(fù)。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 菌絲生長抑制率、芽管生長抑制率及分生孢子萌發(fā)抑制率的測定

采用十字交叉法[11]測量（菌落直徑為測量值減0.6）菌落直徑。用第3天時的病斑直徑來計算菌絲的生長抑制率，具體見式（1）。

用Auto CAD 2017軟件測量芽管長度，以第1天時在掃描電子顯微鏡下拍照記錄的芽管長度來計算芽管生長抑制率，具體見式（2）。

孢子萌發(fā)抑制率以第1天時在電子顯微鏡下觀察到的孢子萌發(fā)情況來計算，參照徐大勇等[12]的方法。每個處理分別取3 個視野進行統(tǒng)計，孢子芽管長度大于孢子直徑的1/2為萌發(fā)，統(tǒng)計孢子總數(shù)及萌發(fā)孢子數(shù)，按式（3）計算萌發(fā)抑制率。

1.3.3.2 病斑直徑及發(fā)病率的測定

每天統(tǒng)計病斑直徑，病斑直徑采用十字交叉法，取平均值；病斑直徑若大于0.5 mm則確定為發(fā)病。發(fā)病率計算見式（4）。

1.3.3.3 抗性酶活力的測定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxldase，POD）、幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力測定參照曹建康等[13]的方法。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定參照高俊鳳[14]的方法，結(jié)果以鮮質(zhì)量計。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用OriginPro 9.0軟件整理并進行方差分析，用Duncan’s做差異顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度CaCl2與山梨酸鉀處理對灰霉菌菌絲生長的抑制

表 1 不同質(zhì)量濃度CaCl2與山梨酸鉀溶液處理對離體灰霉菌菌絲生長的抑制Table 1 Antifungal effect of different CaCl2 and potassium sorbate concentrations on Botrytis cinerea

由表1可看出，各質(zhì)量濃度CaCl2處理與0 g/L CaCl2相比對菌絲生長均有抑制作用，其中20 g/L CaCl2處理組菌絲生長抑制率最大，且與其他CaCl2處理組相比差異顯著（P＜0.05）。山梨酸鉀處理組在各質(zhì)量濃度水平下抑制菌絲生長的效果差異顯著，隨著山梨酸鉀質(zhì)量濃度的升高，對灰霉菌菌絲生長的抑制效果逐漸增強，在第4天時，5、7 g/L山梨酸鉀處理對菌絲生長的抑制率分別為98.18%和100.00%，與1 g/L和3 g/L山梨酸鉀處理組差異顯著（P＜0.05）。5 g/L山梨酸鉀處理組菌絲在前3 d未生長，且4 d時菌絲生長抑制率與7 g/L山梨酸鉀處理之間差異不顯著（P＞0.05）。因此采用采前噴20 g/L CaCl2和采后5 g/L山梨酸鉀浸泡的方式進行后續(xù)實驗。

2.2 CaCl2與山梨酸鉀處理對灰霉菌芽管生長和孢子萌發(fā)的抑制

圖 1 不同處理對培養(yǎng)1 d的灰霉菌芽管生長（A）和孢子萌發(fā)（B）的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effects of different treatments on germ tube growth (A)and spore germination (B) on Botrytis cinerea after 1 day

從圖1可以看出，灰霉菌經(jīng)不同處理培養(yǎng)1 d后，與CK組相比，不同處理對灰霉菌孢子萌發(fā)及芽管生長的抑制程度不同。山梨酸鉀處理組

的芽管長度僅為21 μm，山梨酸鉀處理組與CaCl2+山梨酸鉀處理組的抑制率高達94%與100%，抑制效果均顯著高于CaCl2處理組（P＜0.05）；如圖1B所示，培養(yǎng)1 d后，CK組孢子已經(jīng)完全萌發(fā)，CaCl2、山梨酸鉀、CaCl2+山梨酸鉀處理組的孢子萌發(fā)抑制率分別為26%、84%、100%，CaCl2+山梨酸鉀處理組孢子均未萌發(fā)，其孢子萌發(fā)抑制率顯著低于與其他各組（P＜0.05）。說明CaCl2結(jié)合山梨酸鉀處理對灰霉孢子萌發(fā)的抑制效果最好。

2.3 不同處理對接種灰霉菌后甜櫻桃發(fā)病率的影響

圖 2 不同處理對接種灰霉菌后甜櫻桃病斑直徑（A）和發(fā)病率（B）的影響Fig. 2 Effects of different treatments on lesion size (A) and incidence (B)in sweet cherry infected with Botrytis cinerea

如圖2A所示，病斑直徑隨接種時間延長而迅速擴展，呈逐漸上升趨勢。接種灰霉菌后4 d后，各處理組病斑直徑顯著低于CK組（P＜0.05），其中山梨酸鉀和CaCl2+山梨酸鉀處理能有效限制病斑直徑的擴展，在5 d時病斑直徑分別僅為9.46 mm和9.89 mm，兩處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。

從圖2B可以看出，接種灰霉菌后各組果實均迅速染病，CK組在2 d內(nèi)發(fā)病率高達78.95%，在3 d時全部染病。各處理組發(fā)病率顯著低于CK組，表現(xiàn)出明顯的抗病性。在5 d時，CaCl2、山梨酸鉀和CaCl2+山梨酸鉀處理組比CK組分別降低了23.90%、25.70%、25.77%。

2.4 不同處理對接種灰霉菌后甜櫻桃果實中MDA含量的影響

圖 3 不同處理對接種灰霉菌后甜櫻桃果實MDA含量的影響Fig. 3 Effects of different treatments on MDA content in sweet cherry infected with Botrytis cinerea

如圖3所示，在接種灰霉菌后，甜櫻桃果實MDA含量均呈上升趨勢。與CK組相比，各處理組的MDA含量均能保持較低水平。在接種后2～3 d，CaCl2處理組果實MDA含量最低，鈣能保護細胞膜使其免受損傷。接種后4～5 d，CaCl2+山梨酸鉀處理組的甜櫻桃果實中MDA含量僅為5.37～6.13 mmol/g，顯著低于其他處理組（P＜0.05），說明CaCl2與山梨酸鉀結(jié)合處理可有效減緩果實內(nèi)部氧化自由基對細胞膜的傷害。

2.5 不同處理對接種灰霉菌后甜櫻桃果實PPO和POD活力的影響

由圖4A可知，接種灰霉菌后，PPO活力呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢。各處理組在3 d時達到峰值，此時CaCl2+山梨酸鉀處理組的PPO活力顯著高于其他處理組（P＜0.05），其峰值達0.761 U/g，說明CaCl2結(jié)合山梨酸鉀的處理可以更快地誘導(dǎo)果實PPO活力的上升，并能使PPO活力在較高水平。

由圖4B可知，隨病害的擴展，CK組與各處理組的POD活力總體上均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在整個過程中，各處理組的POD活力顯著高于CK組（P＜0.05）。CK組、CaCl2及山梨酸鉀處理組于接種后3 d達到最大值，其中山梨酸鉀處理組較CK組的POD活力提高了84.9%；CaCl2+山梨酸鉀處理組則在第4天達到峰值，此時其POD活力是CK組的3.01 倍，且在接種后一直處于較高活力水平。

圖 4 不同處理對接種灰霉菌后甜櫻桃PPO（A）和POD（B）活力的影響Fig. 4 Effects of different treatments on PPO (A) and POD (B)activities in sweet cherry infected with Botrytis cinerea

2.6 不同處理對接種灰霉菌后甜櫻桃果實CHI和GLU活力的影響

圖 5 不同處理對接種灰霉菌后甜櫻桃CHI（A）和GLU（B）活力的影響Fig. 5 Effects of different treatments on CHI (A) and GLU (B)activities in sweet cherry infected with Botrytis cinerea

在整個病害觀察期，CHI和GLU活力大致變化趨勢為先增大再緩慢減小。如圖5A所示，接種后1 d開始，CaCl2+山梨酸鉀處理組CHI活力迅速上升，各處理組與CK組差異顯著（P＜0.05）。與其他處理組不同，CaCl2處理組的CHI活力在接種后4 d達到峰值，為22.8 U/g，是CK組的2.57 倍，CaCl2+山梨酸鉀處理組的CHI活力整體上高于單獨CaCl2、山梨酸鉀處理組。

從圖5B可以看出，在接種3 d后，不同處理組GLU活力顯著高于CK組（P＜0.05），CaCl2、山梨酸鉀、CaCl2+山梨酸鉀處理組GLU活力峰值均出現(xiàn)在接種后3 d，分別比CK組高161.45%、171.68%、166.72%，隨后各處理組GLU活力緩慢降低，但在后期仍能夠維持較高的活力。與CK處理相比，CaCl2、山梨酸鉀及CaCl2+山梨酸鉀處理均能在接種3 d后顯著提高這兩種酶的活力，進一步說明CHI和GLU對果實產(chǎn)生抗病相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)作用，從而破壞灰霉菌細胞結(jié)構(gòu)，增強甜櫻桃果實的抗病性。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)山梨酸鉀的抑菌作用可能是通過改變病原菌的細胞和細胞膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，抑制其跨細胞膜的轉(zhuǎn)運，進而抑制氨基酸的運輸，導(dǎo)致病原菌胞內(nèi)的酶系統(tǒng)被破壞[15]。陳福元[16]認為病原菌新陳代謝所必需的飽和脂肪酸的氧化、脫氫、發(fā)生在α、β位上，山梨酸α、β位上的雙鍵阻止了霉菌脫氫生成不飽和脂肪酸，降低了病原菌的新陳代謝。本實驗中，山梨酸鉀質(zhì)量濃度為5 g/L時極大抑制了灰霉菌生長，能抑制灰霉孢子的萌發(fā)。這與Smilanick等[15]研究結(jié)果相似，山梨酸鉀作為抑菌劑在柑橘類水果上使用時，不易被病原菌降解而維持長時間的殘留，從而抑制柑橘類采后青霉病的發(fā)生。胡春紅等[17]研究發(fā)現(xiàn)，當山梨酸鉀質(zhì)量濃度達到8 g/100 mL及以上時，抑菌效果已達到顯著水平；當質(zhì)量濃度為1.0～1.2 g/100 mL時，可抑制79%～90%根霉孢子的萌發(fā)，抑制菌絲及菌落生長且加速其老化、衰退。李自強等[18]發(fā)現(xiàn)用乙醇和山梨酸鉀處理鮮食葡萄與使用SO2對葡萄采后灰霉病的抑制效果相當，并且對葡萄無任何傷害。這些均為山梨酸鉀在水果貯藏保鮮上的應(yīng)用提供了參考。

鈣是構(gòu)成植物細胞壁的重要元素，也是構(gòu)成質(zhì)膜的重要成分[19]，采前噴鈣能維持植物細胞細胞壁和質(zhì)膜在采后的穩(wěn)定性，進而抑制病原菌的入侵[20]。在研究熱液CaCl2處理番木瓜對炭疽病的抑制效果時發(fā)現(xiàn)，Ca2+能與果膠酸形成鹽橋來降低細胞壁降解酶的活力，增強對真菌的抗性[21]。Ca2+結(jié)合在植物的細胞壁和細胞膜上，可減少灰霉菌對細胞壁和細胞膜通透性的改變[22]。因此，CaCl2處理可能是通過增強細胞壁和細胞膜的穩(wěn)定性來抵抗灰霉菌的侵染。本實驗結(jié)果表明，CaCl2處理能夠抑制離體灰霉菌生長，20 g/L CaCl2與5 g/L山梨酸鉀復(fù)合處理對接種1 d內(nèi)的芽管生長抑制率和孢子萌發(fā)抑制率均保持在100%，說明CaCl2和山梨酸鉀在同一時間內(nèi)線性增加了果實對灰霉病的抵抗能力，Youssef等[23]在采前和采后對葡萄用鉀鹽和鈣鹽處理降低了菌絲生長的實驗中證實了這一觀點。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，外源鈣處理降低細胞壁降解酶活力及其基因表達，抑制了細胞壁物質(zhì)的解聚，降低了細胞壁降解酶活力，減緩了果膠、半纖維素的解聚，達到了調(diào)控果實膳食纖維含量、維持果實質(zhì)地品質(zhì)、延長果實貨架期壽命的目的[24]。

在接種實驗中，采前噴20 g/L CaCl2、采后5 g/L山梨酸鉀及二者復(fù)合處理組的甜櫻桃果實病斑直徑及發(fā)病率明顯低于CK組。MDA含量是植物細胞膜質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn)[25]，其能產(chǎn)生氧化自由基加速果實衰老。各處理組甜櫻桃果實中的MDA含量均低于CK組，這與袁陵等[26]得到鈣能有效降低奉節(jié)臍橙褐變膜脂過氧化的結(jié)果相一致。PPO和POD為植物防御體系內(nèi)兩種重要的抗氧化酶類。PPO可將酚類氧化為醌類物質(zhì)，其對入侵的病原菌具有高毒性。POD能夠防止活性氧引起傷害，調(diào)控細胞內(nèi)自由基水平[27-28]。在植物遭受脅迫后，體內(nèi)誘導(dǎo)合成病程相關(guān)蛋白，分解病原菌的細胞結(jié)構(gòu)，植物的抗性反應(yīng)會使CHI和GLU這兩種防御蛋白含量迅速升高，抵抗病原真菌病害[29-31]，進而增強耐貯性[32]。CaCl2與山梨酸鉀處理能使甜櫻桃果實內(nèi)PPO、POD、CHI和接種3 d后的GLU均保持較高活力，誘導(dǎo)櫻桃果實對病原菌產(chǎn)生抗性。以20 g/L CaCl2和5 g/L山梨酸鉀復(fù)合處理的誘導(dǎo)效果最好，可能是CaCl2與山梨酸鉀協(xié)同作用誘導(dǎo)了櫻桃果實自身防御機制產(chǎn)生抗性，有利于甜櫻桃抵抗灰霉菌的侵染，減緩病害的發(fā)生。

4 結(jié) 論

CaCl2和山梨酸鉀處理均能不同程度地抑制灰霉菌菌絲生長，降低孢子的萌發(fā)率，最優(yōu)質(zhì)量濃度為5 g/L山梨酸鉀、20 g/L CaCl2，二者的復(fù)合處理能夠完全抑制灰霉菌孢子萌發(fā)。

在接種實驗中，采前噴20 g/L CaCl2、采后5 g/L山梨酸鉀處理及二者復(fù)合處理明顯降低甜櫻桃的發(fā)病率，抑制病斑的擴展，控制果實中MDA的含量，維持PPO、POD、CHI和接種3 d后的GLU抗性酶的活力處在較高水平，誘導(dǎo)櫻桃果實對灰霉菌的抗性。5 g/L山梨酸鉀和20 g/L CaCl2復(fù)合處理的誘導(dǎo)效果最好。