北京棒桿菌E31天冬氨酸激酶突變體T361D酶學(xué)性質(zhì)表征

陳晨，閔偉紅，張芷睿，方麗

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

天冬氨酸代謝途徑能夠催化生成蘇氨酸、賴(lài)氨酸和甲硫氨酸，這3種氨基酸為人類(lèi)及動(dòng)物體內(nèi)的必需氨基酸，不能依靠自身合成，只能從食物中獲取[1-2]。目前，這幾種氨基酸在醫(yī)藥、食品，保健等方面都有廣泛的應(yīng)用，主要依靠化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法進(jìn)行氨基酸生產(chǎn)，其中，化學(xué)合成法的工藝復(fù)雜，合成過(guò)程中含有毒害物質(zhì)，且產(chǎn)物多為D、L-型混旋體，而微生物發(fā)酵法大多為微生物在合適營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下自發(fā)，氨基酸產(chǎn)物無(wú)污染。但微生物在發(fā)酵過(guò)程中，具有嚴(yán)密的調(diào)節(jié)機(jī)制，若大量生產(chǎn)氨基酸，需打破部分代謝調(diào)控機(jī)制[3]。

在天冬氨酸族氨基酸的代謝途徑中，天冬氨酸激酶（aspartate kinase，AK）作為第一關(guān)鍵酶[4]對(duì)整體途徑具有非常重要的調(diào)控作用[5]，其催化天冬氨酸產(chǎn)生蘇氨酸、賴(lài)氨酸和甲硫氨酸但同時(shí)又受賴(lài)氨酸和蘇氨酸兩種代謝產(chǎn)物的協(xié)同反饋抑制[6]，因此限制了天冬氨酸族氨基酸的產(chǎn)量。如何打破二者對(duì)其的反饋抑制作用，從而使末端氨基酸大量積累，具有重要的研究意義[7-9]。

通過(guò)天冬氨酸激酶的基因序列比對(duì)，證明北京棒桿菌天冬氨酸激酶（AKfromCorynebacteriumpekinense，CpAK）與谷氨酸棒桿菌天冬氨酸激酶（AK from Corynebacterium glutamicum，CgAK） 的同源性高達(dá)99.58%，且反饋抑制機(jī)制相似[10]。并且確定北京棒桿菌T361為保守位點(diǎn)。因此本研究以蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（protein data bank，PDB）中CgAK晶體結(jié)構(gòu)（代碼：3aaw）[11]為模板對(duì)CpAK T361位點(diǎn)進(jìn)行飽和定點(diǎn)突變，采用高通量篩選技術(shù)選擇酶活力提高明顯的T361D突變株，研究T361D AK的酶動(dòng)力學(xué)及酶學(xué)性質(zhì)，為減弱或解除抑制劑對(duì)酶活力的反饋抑制作用與構(gòu)建天冬氨酸族氨基酸基因工程菌提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

北京棒桿菌C.pekinense E31：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保存，其AK基因連接在pET-28a質(zhì)粒上。

1.1.2 培養(yǎng)基

溶菌肉湯（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基[12]（含50μg/mL卡那霉素）：Genview公司。

1.1.3 試劑

PCR試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、電泳Marker、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠試劑盒：大連TaKaRa公司；卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）：Genview公司。

1.1.4 主要儀器

酶標(biāo)儀（infinitieM200）：TECAN 公司；蛋白電泳儀（SE260）：GE Healthcare Bio-Sciences AB 公司；超聲波破碎儀（Scientz-ⅡD）：寧波新芝生物科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)（Z36HK）：德國(guó)HERMLE公司；PCR儀（AG）：eppendorf中國(guó)有限公司。

1.2 飽和突變引物設(shè)計(jì)

運(yùn)用軟件Primer Premier 5對(duì)T361位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)后送至上海生工生物公司進(jìn)行合成，引物設(shè)計(jì)如下（引物中劃線部分NNN為突變位點(diǎn)）：

1.3 重組質(zhì)粒pET-28a-AK提取及定點(diǎn)突變

參照質(zhì)粒提取試劑盒中說(shuō)明進(jìn)行重組質(zhì)粒pET-28a-AK的提取，以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行突變PCR后用于0.1%瓊脂糖凝膠核酸電泳驗(yàn)證[13]，并將驗(yàn)證成功后的產(chǎn)物進(jìn)行消化。

1.4 消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

將1.2 μL消化后的產(chǎn)物導(dǎo)入 BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴后加入900 μL不含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，在37℃、160 r/min條件下培養(yǎng)約 1 h，8 000 r/min離心1 min后保留200 μL上清液，重懸后涂布于LB固體培養(yǎng)基上[14]。

1.5 菌液PCR驗(yàn)證及突變株高通量篩選

將轉(zhuǎn)化成功的菌落保存在含有200 μL LB液體培養(yǎng)基的96孔板中，活化兩次后加入誘導(dǎo)劑IPTG（終濃度為1 mmol/L），30℃、130 r/min誘導(dǎo)8 h。誘導(dǎo)后3 500 r/min離心45 min，棄上清，收集菌體。加入100 μLPBS重懸，在-80℃、30 min和30℃、30 min條件下交替凍融3次～5次，將活力提高明顯的突變株在37℃、180 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)。在克隆引物的作用下，以擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13]，進(jìn)行0.1%瓊脂糖凝膠核酸電泳驗(yàn)證，證明CpAK基因?qū)氲骄w中，同時(shí)取1 mL菌液送至上海生工測(cè)序進(jìn)行高通量篩選，進(jìn)一步確定此菌體是否突變成功，并將篩選成功的突變株菌種保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 AK粗酶液及純化液制備

取2 mL活化后菌液轉(zhuǎn)接至100 mL LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6～0.8，加IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵8 h。4℃、8 000 r/min離心10 min后棄上清液，加10 mL～15 mL預(yù)冷的PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎 14 min，4℃、8 000 rpm 離心 10 min，過(guò) 0.22 μm 濾膜即得AK粗酶液[14]。分別用20 mmol/L咪唑20 mL、40 mmol/L咪唑 15 mL、70 mmol/L咪唑 10 mL、100 mmol/L咪唑5 mL、200 mmol/L 3 mL咪唑進(jìn)行洗滌以除去雜蛋白，再用500 mmol/L咪唑5 mL進(jìn)行洗脫，同時(shí)用15 mLEP管進(jìn)行接樣，所得即為AK純化液[15]。

1.7 SDS-PAGE和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot，WB）驗(yàn)證

將AK的粗酶液及純化液進(jìn)行SDS-PAGE與Western blot驗(yàn)證[16]。

1.8 酶動(dòng)力學(xué)研究

本文研究采用5mL反應(yīng)體系：底物L(fēng)-天冬氨酸10 mmol/L、氨水 800 mmol/L、Tris-HCl緩沖液（pH8.0）100 mmol/L、β-巰基乙醇 10 mmol/L、ATP10.4 mmol/L、硫酸鎂1.6 mmol/L和氯化鉀800 mmol/L。對(duì)于酶動(dòng)力學(xué)研究，需改變底物L(fēng)-天冬氨酸濃度（分別為0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16 mmol/L），反應(yīng)體系中其它條件不變，測(cè)定AK的活力。以Hill方程V=Vmax（Sn）/（Kn+Sn）進(jìn)行線性擬合。

1.9 酶學(xué)性質(zhì)研究

酶學(xué)性質(zhì)的研究與酶動(dòng)力學(xué)研究反應(yīng)體系相同，均為5 mL反應(yīng)體系。

1.9.1 最適pH值研究

反應(yīng)體系其他條件不變，改變Tris-HCL的pH值（從6.0～10.0），測(cè)定AK的最適pH值。每個(gè)PH值檢測(cè)3個(gè)平行，將酶活最高組所對(duì)應(yīng)的pH值定義為100%。

1.9.2 最適溫度研究

反應(yīng)體系不變，在不同溫度下（15、20、25、26、28、30、35、40、45、50℃）測(cè)定 AK 的最適溫度[14]。每個(gè)溫度檢測(cè)3個(gè)平行，將酶活最高組所對(duì)應(yīng)的溫度定義為100%。

1.9.3 穩(wěn)定性研究

反應(yīng)體系其他條件不變，在最適的pH值和溫度下測(cè)定AK的酶活（間隔1 h）。每1個(gè)小時(shí)檢測(cè)3個(gè)平行，對(duì)照組反應(yīng)體系中不含有L-天冬氨酸，在0 h測(cè)量所得的相對(duì)酶活數(shù)值定義為100%。

1.9.4 底物抑制劑對(duì)AK活力的影響

在反應(yīng)體系中添加不同濃度（0.2、1、5、10 mmol/L）的底物抑制劑，分別是：蘇氨酸（Threonine，Thr）、甲硫氨酸（Methionine，Met）、Lys、Thr+Met、Thr+Lys，Lys+Met和Thr+Lys+Met，測(cè)定抑制劑對(duì)AK活力的影響[14]。每組底物抑制劑檢測(cè)3個(gè)平行，共28組試驗(yàn)，對(duì)照組的反應(yīng)體系中不含有底物抑制劑，對(duì)照組相對(duì)酶活數(shù)值定義為100%。

1.9.5 金屬離子對(duì)AK活力的影響

在反應(yīng)體系中添加不同濃度（0.2、1、5、10 mmol/L）的金屬離子，分別是：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+，測(cè)定金屬離子對(duì) AK 活力的影響[14]。每組金屬離子檢測(cè)3個(gè)平行，共36組試驗(yàn)，對(duì)照組的反應(yīng)體系中不含有金屬離子，對(duì)照組相對(duì)酶活力數(shù)值定義為100%。

1.9.6 有機(jī)溶劑對(duì)AK活力的影響

在反應(yīng)體系中添加不同濃度的（0.2、1、5、10mmol/L）有機(jī)溶劑，分別是：甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、乙腈、二甲基亞砜、甘油，測(cè)定有機(jī)溶劑對(duì)AK活力的影響[14]。每組有機(jī)溶劑檢測(cè)3個(gè)平行，共28組試驗(yàn)，對(duì)照組的反應(yīng)體系中不含有有機(jī)溶劑，對(duì)照組相對(duì)酶活力數(shù)值定義為100%。

1.10 數(shù)據(jù)分析

進(jìn)行3組平行試驗(yàn)并用平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD，x±s）表示。采用 SPSS19.0及 Origin8.5進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體T361D重組菌的構(gòu)建

突變PCR及菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖核酸電泳驗(yàn)證Fig.1 1%agarose nucleic acid electrophoresis verification of PCR products

突變PCR結(jié)果如圖1A，分別在54、56、58℃3個(gè)退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。約7 000 bp處出現(xiàn)目標(biāo)條帶，這與pET-28a-AK質(zhì)粒長(zhǎng)度6 822 bp（pET-28a 5 369 bp，CpAK 1 453 bp）相一致，結(jié)果表明了在退火溫度下，質(zhì)粒復(fù)制成功，引物在重組質(zhì)粒的作用下實(shí)現(xiàn)了大量擴(kuò)增。

菌液PCR結(jié)果如圖1B，約1 000 bp～2 000 bp之間存在目標(biāo)條帶，且與AK長(zhǎng)度1 453 bp相對(duì)應(yīng)，證明AK基因已導(dǎo)入BL21感受態(tài)細(xì)胞。測(cè)序（由上海生工進(jìn)行）結(jié)果表示361位點(diǎn)氨基酸由T變?yōu)镈，進(jìn)一步驗(yàn)證已成功構(gòu)建突變體T361D。

2.2 SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證

SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 12%SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Results of 12%SDS-PAGE and Western blot

如圖2A所示，經(jīng)純化后突變體在48KDa位置處出現(xiàn)條帶；Western blot驗(yàn)證結(jié)果如圖2B所示，野生型和突變體T361D在48KDa位置處出現(xiàn)條帶，證明突變后AK表達(dá)成功。

2.3 T361D動(dòng)力學(xué)結(jié)果

野生型（wild type，WT）和T361D動(dòng)力學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 WT和T361D動(dòng)力學(xué)結(jié)果Fig.3 Dynamics result of WT and T361D

如圖3所示，T361D AK的最大反應(yīng)速率Vmax為25.34 U/mg·min，較 WT（Vmax 為 3.32 U/mg·min）提高了7.63倍；T361D AK的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值為4.60，與WT Km為4.13相比有所提高，說(shuō)明T361D AK與底物的親和力下降；WT的希爾系數(shù)n值為4.57，T361D AK n值為1.26，突變后n值明顯低于野生型，證明正協(xié)同效應(yīng)降低，突變后更趨于米氏酶，結(jié)合位點(diǎn)由致密結(jié)構(gòu)變成松散結(jié)構(gòu)，因此不利于與抑制劑相結(jié)合。

2.4 T361D酶學(xué)性質(zhì)表征

2.4.1 最適溫度和最適pH值

最適溫度和最適pH值研究結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 WT和T361D最適溫度（A）與PH值（B）Fig.4 The effect of optimum temperature(A)、pH(B)to WT and T361D

如圖4A所示，與WT相比T361D的最適溫度由26℃升高至30℃，在15℃～30℃區(qū)間內(nèi)，酶活力逐漸升高并達(dá)到峰值，在30℃～50℃區(qū)間內(nèi)，酶活力逐漸降低；如圖4B所示，與WT相比T361D最適pH值從7.5降低到7.0，當(dāng)pH值小于7時(shí)，酶活力逐漸增高并達(dá)到峰值，而在大于7時(shí)，酶活力逐漸降低，當(dāng)pH值達(dá)到10時(shí)，酶活力已不足10%。

這表明當(dāng)溫度或pH值較低時(shí)，大部分酶的活性也較低，可以用于酶的保存；當(dāng)溫度或pH值在最適區(qū)間時(shí)，酶的活性可逐漸達(dá)到最大，并對(duì)酶的催化反應(yīng)有利；當(dāng)溫度或pH值過(guò)高時(shí)，會(huì)使酶發(fā)生變性，逐漸失去活力。

2.4.2 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性研究結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 WT和T361D的熱穩(wěn)定性Fig.5 The stability curves of WT and T361D

表1 金屬離子對(duì)WT與T361D酶活力的影響Table 1 The influence of metalions on the enzyme activity WT and T361D

如圖5所示，在最適的溫度（30℃）和pH（7.0）的情況下，測(cè)定WT和T361D酶活力和時(shí)間的關(guān)系[17-18]。野生型和突變體T361D的半衰期分別為3.9 h和4.9 h，突變后半衰期延長(zhǎng)1 h，說(shuō)明突變后AK的穩(wěn)定性增強(qiáng)。

2.4.3 金屬離子對(duì)AK活力的影響

金屬離子對(duì)AK活力的影響見(jiàn)表1。

由表1可知，對(duì)于WT的影響，Mg2+和Mn2+對(duì)野生型有不同程度的激活作用，而 Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+和Ni2+對(duì)野生型均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用；對(duì)T361D AK的影響，一價(jià)金屬離子Na+和K+對(duì)酶產(chǎn)生明顯的激活作用；二價(jià)金屬離子，只有0.2 mmol/L的Mn2+表現(xiàn)出激活作用，其它金屬離子均有不同程度的抑制作用；三價(jià)金屬離子Fe3+產(chǎn)生抑制作用。

2.4.4 有機(jī)溶劑對(duì)AK活力的影響

有機(jī)溶劑對(duì)AK活力的影響見(jiàn)表2。

表2 有機(jī)溶劑對(duì)WT與T361D酶活力的影響Table 2 The influence of organic solvent on the enzyme activity WT and T361D

由表2可知，對(duì)于WT的影響，0.2 mmol/L與1 mmol/L的乙醇對(duì)野生型AK表現(xiàn)出激活作用，其他有機(jī)溶劑均有著不同程度的抑制作用；對(duì)T361D AK的影響，甲醇、異丙醇對(duì)AK的酶活力均有明顯提高，尤以濃度為10 mmol/L的甲醇和5 mmol/L、10 mmol/L的異丙醇對(duì)AK激活作用顯著，其他有機(jī)溶劑如正丁醇、乙腈對(duì)AK基本無(wú)激活，而乙醇、二甲基亞砜和甘油對(duì)AK酶活力均起到不同程度的抑制作用。

2.4.5 底物抑制劑對(duì)AK活力的影響

底物抑制劑對(duì)AK活力的影響見(jiàn)表3。

表3 底物抑制劑對(duì)WT與T361D酶活力的影響Table 3 The influence of substrate inhibitors on the enzyme activity of WT and T361D

由表3可知，對(duì)于 WT 的影響，在 Thr、Lys、Thr+Lys、Thr+Lys+Met存在條件下對(duì)野生型存在較強(qiáng)的抑制作用，在 Met、Thr+Met、Lys+Met存在條件下對(duì)野生型仍存在一定的抑制作用，但這些含有Met的組合均不同程度減弱了抑制作用；對(duì)T361D AK的影響，Met、Thr+Met存在條件下對(duì)T361D仍起到抑制作用，Thr+Lys+Met存在條件下仍存在抑制作用，但較野生型有明顯提高，Thr和Lys單獨(dú)存在時(shí)酶活力提高明顯，且表現(xiàn)出激活作用，Thr+Lys和Lys+Met的條件下活力提高明顯，且在高濃度條件下表現(xiàn)出激活作用。因此，說(shuō)明在Lys或含有Lys的組合存在下對(duì)T361D的抑制作用部分解除，對(duì)AK酶活力產(chǎn)生激活作用，正與本研究的目的相符。

2.5 野生型及突變體T361D的空間結(jié)構(gòu)比較

CgAK晶體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6。

圖6 CgAK晶體結(jié)構(gòu)（PDB：3aaw）Fig.6 CgAK crystal structure（PDB：3aaw）

如圖6所示，CgAK晶體結(jié)構(gòu)（3aaw，PDB）[11]中的 4個(gè)區(qū)域代表4個(gè)亞基，中間部分表示α亞基，兩側(cè)表示β亞基，α亞基和β亞基上都存在賴(lài)氨酸和蘇氨酸抑制劑結(jié)合位點(diǎn)[19]，當(dāng)有賴(lài)氨酸或蘇氨酸結(jié)合時(shí)，導(dǎo)致AK的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，不利于底物與AK結(jié)合，會(huì)使AK活力降低，對(duì)酶起抑制作用。T361D空間結(jié)構(gòu)比較見(jiàn)圖7。

圖7 T361D空間結(jié)構(gòu)比較Fig.7 T361D spatial structure comparison

由圖7可知，突變后氨基酸側(cè)鏈官能團(tuán)發(fā)生了改變，使氨基酸所帶電荷和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，由極性不帶電轉(zhuǎn)變?yōu)閹ж?fù)電，且突變后AK與抑制劑Lys間發(fā)生離子鍵斷裂，R基遠(yuǎn)離抑制劑Lys，因此抑制劑Lys穩(wěn)定性降低，解除了抑制劑對(duì)AK酶活力的影響。

3 結(jié)論

對(duì)北京棒桿菌天冬氨酸激酶T361位點(diǎn)進(jìn)行突變，從而解除與抑制劑Lys的離子鍵作用且將酶活提高。T361D與WT相比，酶動(dòng)力學(xué)Vmax提高了7.63倍；最佳pH值降低至7.0，最佳反應(yīng)溫度提升至30℃；半衰期由野生型的3.9 h延長(zhǎng)到4.9 h；同時(shí)，突變體T361D對(duì)金屬離子Na+、K+和有機(jī)溶劑甲醇、異丙醇均表現(xiàn)出良好的抗性；底物抑制劑Lys以及含有Lys的組合對(duì)突變體T361D的抑制作用部分解除并表現(xiàn)出激活作用。綜上所述，本研究為解除AK的反饋抑制作用，從而獲得高產(chǎn)的天冬氨酸族氨基酸菌株提供了一定的理論依據(jù)。