余甘子多糖體外降血糖及抗氧化活性研究

（昭通學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昭通657000）

余甘子（Phyllanthus emblica L.）是大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠屬（Phyllanthus）余甘子的果實，主產(chǎn)于熱帶、亞熱帶地區(qū)。余甘子性涼、味甘，可清熱涼血、生津止咳、健胃消食、保肝、降壓等。余甘子是一種重要的藥食兩用植物資源，余甘子含有豐富的維生素、黃酮、皂苷、多酚及多糖等活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抑制病毒、增強免疫力、降血糖等生物活性[1-6]。云南是全國余甘子分布最廣，產(chǎn)量最高的省份之一，年產(chǎn)鮮果約10萬噸[7]。目前，云南省的余甘子資源尚未充分開發(fā)利用，余甘子多以未經(jīng)過深加工的余甘子粉、余甘子果脯、余甘子飲料等形式出售，產(chǎn)品附加值低。本試驗對余甘子多糖進行了體外降血糖及抗氧化活性研究，為其在保健食品中的開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)，以促進地方特色植物資源的綜合開發(fā)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

余甘子鮮果：云南省楚雄市；1，1-二苯-2-苦肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-N-tro phenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）：美國 Sigma公司；阿卡波糖（Acarbose）：德國拜耳公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6210真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JHF-350A型高速多功能粉碎機：昆明鐵申商貿(mào)有限公司；SK5200LHC超聲波洗滌器：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；PHS-25數(shù)顯pH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV/VIS2802PCS紫外-可見分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司。

2 方法

2.1 余甘子多糖制備

將新鮮余甘子清洗去核，70℃烘干粉碎，過40目篩，加入30倍體積80%乙醇，超聲（53 kHz，250 W）浸提，除去其中的脂類、色素、單糖等成分，抽濾、晾干回收粉末；按料液比 1∶30（g/mL），向粉末中加入去離子水，置于100℃水浴中浸提90 min，抽濾得濾液，將濾液真空濃縮至一定體積，向濃縮液中加入無水乙醇使乙醇濃度為80%，充分攪拌，密封放入4℃冰箱靜置24 h，離心分離得沉淀；所得沉淀加入適量去離子水溶解，用Sevag試劑（體積比1∶4氯仿正丁醇混合液）除蛋白，將脫蛋白后的溶液進行二次醇沉，沉淀用無水乙醇洗滌3次，真空干燥，得余甘子多糖。

2.2 余甘子多糖含量測定

采用苯酚-硫酸比色法，測定余甘子多糖含量[8-9]。分別準確量取50 μg/mL葡萄糖對照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 于試管中，補充去離子水至溶液體積為1.0 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，搖勻，浸入冰水浴中，分別加入4 mL濃硫酸，搖勻，置于沸水浴反應(yīng)15 min，取出迅速冷卻，室溫平衡5 min，用未加對照品的空白溶液作參比，490 nm波長處測吸光度值，以對照品質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標，吸光度值Y為縱坐標，建立標準曲線，得回歸方程：Y=0.0114X-0.0203，r=0.999 3。同法測定樣品的吸光度值，根據(jù)回歸方程，計算出樣品中多糖含量。

2.3 余甘子多糖降血糖活性測定

α-淀粉酶抑制劑和α-葡萄糖苷酶抑制劑可通過延緩人體腸道對淀粉等物質(zhì)的降解和葡萄糖的消化、吸收，抑制餐后血糖升高，從而有助控制糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展[10]。通過體外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性試驗測定余甘子多糖的降血糖作用，并與阿卡波糖做陽性對照進行比較。

2.3.1 α-淀粉酶抑制活性測定

采用 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法測定α-淀粉酶抑制劑活性[11]。取適量待測樣品溶液于試管中，補充50 mmol/L，pH6.8磷酸鈉緩沖液至1.0 mL，加入10 U/mL，α-淀粉酶溶液1 mL，37℃孵育10 min，加入1%淀粉溶液1 mL，37℃孵育5 min，加入DNS試劑[12]1 mL置于沸水浴中反應(yīng)5 min，冷水浴迅速冷卻，加3 mL去離子水稀釋后540 nm波長處測吸光度值。每個樣品重復(fù)3次取平均值，酶活性抑制率按（1）式計算。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標，酶活性抑制率為縱坐標，用origin軟件繪制抑制曲線圖，求出相應(yīng)的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

式中：ODx為待測溶液的吸光度值；ODxo為待測溶液的本底吸光度值；ODo為空白對照溶液的吸光度值；ODoo為空白對照溶液的本底吸光度值。

2.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

參考文獻[13]的方法，并有所改變。以PNPG為底物，在試管中加入一定量不同濃度待測溶液，補充50 mmol/L，pH6.8磷酸鈉緩沖液至3.0 mL，加入α-葡萄糖苷酶（終濃度為7.5 U/mL）與PNPG（終濃度為2.5 mmol/L）各0.5 mL，混勻，37℃恒溫反應(yīng)30 min后，加入1 mol/L碳酸鈉溶液1 mL終止反應(yīng)，置于405 nm波長處測定吸光度值。每個樣品重復(fù)3次取平均值，酶活性抑制率按（1）式計算。用origin軟件繪制抑制曲線圖，求出相應(yīng)的IC50值。

2.4 余甘子多糖抗氧化活性測定

采用羥自由基（·OH）、超氧自由基（O2-·）和 1，1-二苯-2-苦肼自由基（DPPH·）清除法測定余甘子多糖的抗氧化活性，并以維生素C做陽性對照進行比較。

2.4.1·OH清除活性測定

取2 mmol/L硫酸亞鐵溶液和6 mmol/L水楊酸溶液各3 mL于10 mL比色管中，加入不同濃度的待測溶液0.1 mL，補充去離子水至8.5 mL，最后加入17.6 mmol/L過氧化氫溶液1.5 mL啟動反應(yīng)，37℃恒溫反應(yīng)30 min，取出，室溫平衡5 min，置于510 nm波長處測吸光度值[14]，每個樣品重復(fù)3次取平均值，自由基清除率按（2）式計算。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標，自由基清除率為縱坐標，用origin軟件繪制清除曲線圖，求出相應(yīng)的IC50值。

式中：Ax為待測溶液后的吸光度值；Axo為待測溶液的本底吸光度值；Ao為空白對照溶液的吸光度值；Aoo為空白對照溶液的本底吸光度值。

2.4.2 O2-·清除活性測定

采用鄰苯三酚自氧化法[15]。在試管中加入不同濃度待測溶液1 mL及50 mmol/L，pH8.2的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液5.0 mL，混勻，25℃水浴中預(yù)熱20 min，加入25℃預(yù)熱20 min的100 mmol/L鄰苯三酚溶液0.5 mL，搖勻，25℃水浴反應(yīng)30 min后用0.2 mL，10 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，置于420 nm波長處測吸光度值。每個樣品重復(fù)3次取平均值，自由基清除率按（2）式計，并用origin軟件求出IC50值。

2.4.3 DPPH·清除活性測定

參照文獻[5]的方法，測定余甘子多糖對DPPH·清除作用。每個樣品重復(fù)3次取平均值，代入（2）式計算自由基清除率，并用origin軟件求出IC50值。

3 結(jié)果與分析

3.1 余甘子多糖含量

按照前述多糖提取和測定方法，測得純化余甘子多糖得率為6.51%；以葡萄糖計，純化余甘子多糖中的多糖含量為48.94%，較高路等[16]所測含量（44.62%）高，說明該提取方法更有利于余甘子中多糖的浸提。

3.2 余甘子多糖的降血糖活性

3.2.1 對α-淀粉酶的抑制作用

余甘子多糖及阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制作用見圖1。

圖1 余甘子多糖對α-淀粉酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of Phyllanthus emblica L.polysaccharide on α-amylase

如圖1所示，低濃度時，阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制作用快速增加，IC50值為0.45 mg/mL，但隨著濃度增高，其抑制作用變化平緩，最大抑制率約為74%；而余甘子多糖在質(zhì)量濃度0.50 mg/mL～4.00 mg/mL時，能劑量依賴性地抑制α-淀粉酶活性，其IC50值為1.67 mg/mL，當質(zhì)量濃度為4.00 mg/mL，抑制率即可達到96.47%，若繼續(xù)增加濃度，余甘子多糖幾乎可完全抑制α-淀粉酶活性。因此，余甘子多糖是一種理想的α-淀粉酶抑制劑。

3.2.2 對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

不同濃度余甘子多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖2。

圖2 余甘子多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Phyllanthus emblica L.polysaccharide on α-glucosidase

如圖2所示，在試驗質(zhì)量濃度0.75 mg/mL～1.625 mg/mL，余甘子多糖對α-葡萄糖苷酶具有一定抑制活性，且抑制作用與質(zhì)量濃度呈良好的量效關(guān)系，其IC50值為0.89 mg/mL，當濃度為1.625 mg/mL時，抑制率可達95.46%；而陽性對照阿卡波糖雖低濃度時對α-葡萄糖苷酶抑制作用強，IC50值為0.04 mg/mL，但當濃度高于0.5 mg/mL時，抑制率不再增大，維持在86%左右，最大抑制率低于余甘子多糖。因此，余甘子多糖是一種較好的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

3.3 余甘子多糖的抗氧化活性

3.3.1 對·OH的清除作用

自由基清除率越高表明提取物抗氧化活性越強，余甘子多糖對·OH清除作用見圖3。

圖3 余甘子多糖對·OH的清除作用Fig.3 Scavenging effect of Phyllanthus emblica L.polysaccharide on·OH

如圖3所示，試驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，余甘子多糖對·OH的清除作用增強，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，在0.68 mg/mL達到最大值63.14%，IC50值為0.45 mg/mL；維生素C在0.35 mg/mL時清除率達到了98.90%，IC50值為0.16 mg/mL。表明，余甘子多糖對·OH具有一定的清除能力，但較維生素C的清除能力弱。

3.3.2 對O2-·的清除作用

余甘子多糖和維生素C對O2-·清除作用見圖4。

圖4 余甘子多糖對O2-·的清除作用Fig.4 Scavenging effect of Phyllanthus emblica L.polysaccharide on O2-·

如圖4所示，在試驗濃度范圍內(nèi)，維生素C對O2-·清除率基本上不隨濃度的變化而變化，均接近100%；而余甘子多糖隨著濃度的增大，清除率增強，余甘子多糖與清除率二者之間存在較好的劑量依賴性，其IC50值為2.32 mg/mL，最大抑制率為88.52%，表明余甘子多糖對O2-·的清除活性弱于維生素C。

3.3.3 對DPPH·的清除作用

余甘子多糖對DPPH·的清除作用見圖5。

圖5 余甘子多糖對DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging effect of Phyllanthus emblica L.polysaccharide on DPPH·

由圖5可知，在質(zhì)量濃度6.00 mg/L～31.00 mg/L，余甘子多糖對DPPH·的清除作用隨質(zhì)量濃度的增大而迅速增強，之后對DPPH·清除作用達到飽和狀態(tài)，清除率隨濃度變化趨于平穩(wěn)。其IC50值為9.92mg/L，最大清除率為90.78%；維生素C的IC50值為5.79 mg/L，最大清除率為93.56%。表明余甘子多糖低濃度時清除DPPH·的能力弱于維生素C，而高濃度時清除DPPH·的作用與維生素C相當。

4 結(jié)論與討論

植物多糖具有抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血糖、抗凝血、抗氧化等多種藥理作用[17]。多糖作為余甘子的主要活性成分之一，含量豐富，通過水提醇沉，純化后所得余甘子多糖為48.94%。研究報道，余甘子提取物可明顯改善胰島素抵抗[18]，余甘子水提物對四氧嘧啶所致小鼠具有顯著的降血糖作用[19]，這與其所含多糖有關(guān)。碳水化合物如淀粉先經(jīng)α-淀粉酶水解生成麥芽糖等，后經(jīng)α-葡萄糖苷酶進一步水解生成葡萄糖，從而促進人體吸收利用，引起餐后血糖升高。本研究通過體外化學(xué)模型試驗表明，余甘子多糖可有效抑制α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶活性，說明余甘子多糖可能對淀粉酶解到生成葡萄糖過程中都產(chǎn)生了作用，延緩或抑制了葡萄糖的生成，有助緩解餐后血糖峰值[10]。雖然低濃度時，余甘子多糖對兩種酶活性抑制作用均弱于陽性對照阿卡波糖，但隨著濃度的升高，其抑制活性增強，抑制率均達95%以上，顯著高于阿卡波糖，其抑制作用在試驗范圍內(nèi)具有良好的量效關(guān)系。同時，余甘子多糖對·OH、O2-·和DPPH·具有一定的清除作用，因此還可以減緩糖尿病患者氧化應(yīng)激，有效預(yù)防糖尿病并發(fā)癥[6，20]。余甘子作為藥食兼用植物，急性毒性及長期毒性實驗表明無毒副作用[21]，故其作為一種安全、天然的降血糖、抗氧化保健品或藥物具有良好的開發(fā)前景。