基于瓊脂擴散法的抗菌肽定量測定方法優(yōu)化

魏東東，劉楊柳，王志新，郭潤芳，賈英民，于宏偉，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京100048；3.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）

抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是生物有機體在抵抗外源病原微生物時所產(chǎn)生的一種防御性肽類活性物質(zhì)，也被稱為肽類抗生素[1]（peptide antibiotics）。其來源廣，分子量小，熱穩(wěn)定性高，不僅具有廣譜的抗細(xì)菌活性，還對真菌、病毒和寄生蟲有一定的活性[2-3]。目前已報道的抗菌肽多以陽離子型多肽為主，作用機理與抗生素不同[4]，對抗生素耐藥菌株表現(xiàn)出較高的抑菌活性，不易產(chǎn)生耐藥性[5]，有望成為抗生素的良好替代品，在醫(yī)學(xué)臨床[6]、食品防腐[7]、飼料添加劑[8]等領(lǐng)域均具有廣闊應(yīng)用前景。然而，抗菌肽在進入實際應(yīng)用前尚無系統(tǒng)完備的安全評價體系和標(biāo)準(zhǔn)[5]，而作為安全評價中最基礎(chǔ)的定量研究更是鮮有研究者涉足，致使抗菌肽定量測定方法不統(tǒng)一，相關(guān)研究不具備可比性。

目前，針對抗菌肽定量測定方面，國內(nèi)外尚無明確統(tǒng)一的方法，大部分采用類似于抗生素定量測定的方法——微生物檢定法和理化檢定法[9]。如《中華人民共和國藥典》所采用的方法為管碟法和濁度法。通過量反應(yīng)平行原理，即同等劑量的待測品與生物標(biāo)準(zhǔn)品抑菌效果一致，進而對待測樣品進行標(biāo)定。應(yīng)用時必須具備生物標(biāo)準(zhǔn)品，而抗菌肽因來源廣、種類多、組分復(fù)雜生物標(biāo)準(zhǔn)品在制備和評價時有一定難度，且無法像抗生素那樣使用重量進行效價標(biāo)定。因此，這兩種方法均未在實驗室研究中得以推廣。理化檢定法，如高效液相色譜法和紫外分光光度法在實驗室相關(guān)研究中也常用到。但是其測量結(jié)果不能直接反映抗菌肽的抑菌效能，因此短期內(nèi)很難代替微生物檢定法[10]。現(xiàn)階段實驗室普遍采用的是二倍稀釋法，該法操作簡便，但在確定最低抑菌濃度時，主要通過肉眼識別，人為因素給試驗帶來一定的誤差[11]；本試驗所采用的瓊脂擴散法根據(jù)抗菌肽濃度對數(shù)值與抑菌圈直徑之間存在線性關(guān)系來確定最低抑菌濃度，繼而求得抗菌肽效價[12]，既解決了抗菌肽沒有標(biāo)準(zhǔn)品的現(xiàn)狀，又使用統(tǒng)計學(xué)方法避免了人為主觀影響，所得結(jié)果更具有可信度。該種方法操作簡單，成本較低，能夠滿足實驗室的測定要求。瓊脂擴散法中最主要的數(shù)據(jù)是抑菌圈的大小，其中菌種的生長活力、形態(tài)、培養(yǎng)時期、菌液濃度以及培養(yǎng)基的厚度、瓊脂濃度都會對抑菌圈的大小、清晰度產(chǎn)生影響[13]。因此，對瓊脂擴散法中的相關(guān)試驗因子進行優(yōu)化對提高測定結(jié)果的可信度具有重要意義。

本試驗以硫酸多粘菌素B為例，以重復(fù)性和精密度為指標(biāo)，對瓊脂擴散法試驗中所涉及的指示菌培養(yǎng)時期、濃度，培養(yǎng)基的瓊脂濃度和厚度對瓊脂擴散法的影響進行探討并對各影響因素進行優(yōu)化，確定抗菌肽定量測定的最佳試驗條件。同時，采用桿菌肽和大腸桿菌進行重復(fù)驗證試驗，以期得到重復(fù)性好，精密度高，具有高度適用性的抗菌肽定量測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硫酸多粘菌素B、桿菌肽：上海麥克林生化科技有限公司；瓊脂培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；銅綠假單胞菌ATCC9027、大腸桿菌ATCC25922：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

牛津杯（內(nèi)徑6.0mm±0.1mm，外徑8.0 mm±0.1 mm）：武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司；一次性平板（90 mm×20 mm）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；游標(biāo)卡尺：日本三豐（Mitutoyo）公司。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌生長曲線的測定

挑取銅綠假單胞菌單菌落，接種于5 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37℃搖床中震蕩培養(yǎng)12 h，作為生長曲線測定用種子液，取銅綠假單胞菌種子液，按照0.1%接種于100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37℃搖床中震蕩培養(yǎng)。采用稀釋涂布法進行菌落計數(shù)并測定OD值。

1.2.2 硫酸多粘菌素B標(biāo)準(zhǔn)液的制備

精確稱取0.05g硫酸多粘菌素B，溶于500μL無菌磷酸鹽緩沖溶液（pH6.0）中[14]，使其濃度為100mg/mL震蕩均勻分裝于離心管中，于-20℃保存。使用時，將標(biāo)準(zhǔn)液用pH 6.0的無菌磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度。

1.2.3 抑菌試驗

將按照生長曲線的方法培養(yǎng)銅綠假單胞菌，使用pH 6.0的磷酸鹽緩沖液對菌液進行稀釋，使菌液OD600至0.8，備用。

將滅菌的營養(yǎng)瓊脂冷卻至45℃～50℃，按照2%接種1.2.1中指示菌稀釋液，混勻。等量分裝至培養(yǎng)皿中，冷卻后，等距離安放牛津杯。在牛津杯中加入50 μL不同稀釋度的硫酸多粘菌素B稀釋液，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h～16 h，每個試驗4個平行，重復(fù)3次。使用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，每個抑菌圈測量3次，并記錄平均值。

測定方法的穩(wěn)定性（即重復(fù)試驗中斜率和截距的一致程度）以回歸直線斜率和截距的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來判斷。精密度（即在規(guī)定條件下，對同一或類似被測對象重復(fù)測量所得示值間的一致程度）用來驗證在給定濃度范圍內(nèi)回歸方程的有效性，以回歸方程的回歸系數(shù)來判斷。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

以硫酸多粘菌素B濃度對數(shù)值為自變量，其所對應(yīng)的抑菌圈直徑為因變量，在Origin Professional 8.0軟件中進行線性回歸。并對斜率、截距、決定系數(shù)R2進行單因素方差分析，計算平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差[15]。

1.2.5 效價定義

采用牛津杯瓊脂擴散法，在規(guī)定的條件下，經(jīng)抗菌肽濃度與抑菌圈直徑所得線性方程計算所得抑菌圈直徑為0時，所對應(yīng)的抗菌肽質(zhì)量為一個活力單位1AU。

式中：V為牛津杯中所加抗菌肽的體積，μL；X0為抗菌肽濃度對數(shù)值與抑菌圈直徑所得線性方程的x軸截距。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單孢菌生長曲線

銅綠假單孢菌生長曲線見圖1。

圖1 銅綠假單胞菌生長曲線Fig.1 Growth curves of Pseudomonas aeruginosa

由圖1可知，銅綠假單孢菌在培養(yǎng)2 h以后，進入對數(shù)生長期；10 h時為對數(shù)末期；10 h以后進入穩(wěn)定期，菌濃度為 8.5 lg（cfu/mL）。

2.2 抗菌肽濃度選擇

Tramer J等在使用瓊脂擴散法檢測食品中乳酸鏈球菌素（Nisin）的含量時發(fā)現(xiàn)，一定濃度范圍內(nèi)Nisin濃度的對數(shù)值與抑菌圈直徑之間存在線性關(guān)系[16-17]。為驗證該種方法對硫酸多粘菌素B是否具有適用性，本研究采用不同濃度的硫酸多粘菌素B，進行抑菌試驗（見圖2），線性關(guān)系見圖3。

圖2 不同濃度硫酸多粘菌素B抑菌試驗Fig.2 Different concentrations of polymyxin B sulfate antibacterial

圖3 抗菌肽濃度對數(shù)值與抑菌圈直徑間的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship between logarithm of antibacterial peptide concentration and diameter of zone of inhibition

結(jié)果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL濃度下，硫酸多粘菌素B濃度的對數(shù)值與抑菌圈直徑之間線性關(guān)系良好（R2=0.991 8），因此選擇 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的濃度作為硫酸多粘菌素B效價測定試驗用的稀釋濃度。

2.3 指示菌濃度

將硫酸多粘菌素 B 系列稀釋液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）在不同指示菌濃度（104、105、106cfu/mL）的平板中進行擴散。指示菌濃度對斜率、截距及決定系數(shù)的影響見表1。

表1 指示菌濃度對斜率、截距及決定系數(shù)的影響Table 1 Effect of indicator concentration on slope，intercept and coefficient of determination

如表1所示，銅綠假單胞菌濃度為104cfu/mL與105和106cfu/mL相比，斜率有顯著性差異（p<0.05），截距方面指示菌濃度106cfu/mL與104、105cfu/mL有顯著性差異（p<0.05）。說明指示菌濃度對瓊脂擴散法影響顯著。當(dāng)指示菌濃度為104cfu/mL時，其精密度較差（R2=0.988），斜率和截距的重復(fù)性相對較差。指示菌濃度為105、106cfu/mL時，其穩(wěn)定性和精密度逐漸趨好，到106cfu/mL時達到最好。同時試驗中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)指示菌濃度較低時，抑菌圈邊緣不清晰，存在顆粒感，易給測量帶來較大誤差。故選擇銅綠假單胞菌濃度為106cfu/mL作為試驗用最佳指示菌濃度。

2.4 培養(yǎng)基厚度

將0.2 mg/mL～1.0 mg/mL的硫酸多粘菌素B在不同厚度（1.57、2.36、3.15、3.93、4.72、5.50 mm）的培養(yǎng)基中進行擴散。所得結(jié)果如表2。

表2 培養(yǎng)基厚度對斜率、截距及決定系數(shù)的影響Table 2 Effect of medium thickness on slope，intercept and coefficient of determination

當(dāng)培養(yǎng)基厚度大于3.15 mm時，對斜率和截距均沒有顯著性影響（p>0.05），且重復(fù)性和精密度均較差，推測當(dāng)培養(yǎng)基體積較少時導(dǎo)致瓊脂平板薄厚不均勻，不利于抗菌肽在瓊脂中均勻擴散[16]。因此，進行擴散試驗時要盡可能保證瓊脂平板薄厚均勻，冷卻時要避免放在坡度的平面上。故選擇3.15 mm作為抑菌試驗中培養(yǎng)基的厚度。

2.5 瓊脂糖濃度

瓊脂糖的添加量會影響硫酸多粘菌素B的擴散速率，當(dāng)瓊脂糖濃度過低，也會影響抑菌圈的清晰程度，在Nisin效價定量測定的試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)瓊脂糖濃度為0.5%時，瓊脂凝膠呈現(xiàn)水化現(xiàn)象[17]，故選擇瓊脂糖濃度為1.0%、1.5%、2.0%，進行試驗。瓊脂糖濃度對斜率、截距及決定系數(shù)的影響見表3。

表3 瓊脂糖濃度對斜率、截距及決定系數(shù)的影響Table 3 Influence of agarose concentration on slope，intercept and coefficient of determination

由表3可知，在瓊脂糖濃度1%～2%的范圍內(nèi)，其對斜率和截距的影響并不顯著（p>0.05），但是當(dāng)瓊脂糖濃度為1.0%時，其精密度較差。當(dāng)抗菌肽的擴散速率大于菌的生長速率時，易于形成模糊的抑菌圈[17]。試驗中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)瓊脂糖濃度為1.0%時，所形成抑菌圈邊緣模糊，測量結(jié)果誤差大，這可能是導(dǎo)致上述結(jié)果出現(xiàn)的原因，故選擇瓊脂糖濃度為1.5%作為試驗用最佳濃度。

2.6 指示菌的培養(yǎng)時期

根據(jù)銅綠假單胞菌生長曲線選擇培養(yǎng)6、10、14 h的菌作為試驗用指示菌，分別代表菌的對數(shù)期、對數(shù)末期和穩(wěn)定期。不同生長時期對斜率、截距及決定系數(shù)的影響見表4。

如表4所示，銅綠假單胞菌的培養(yǎng)時期為對數(shù)期和對數(shù)末期時，其對斜率的影響并不顯著（p>0.05），對截距的影響顯著（p<0.05），對數(shù)末期之后，兩者均沒有顯著性差異。據(jù)文獻報道，大部分抗菌肽的作用機理與細(xì)菌細(xì)胞膜膜電位有關(guān)，而細(xì)胞膜膜電位在不同培養(yǎng)時期的變化情況不同[18-19]，給抑菌試驗的重復(fù)性帶來一定的影響。從重復(fù)性方面考慮，選擇處于穩(wěn)定時期（14 h）的銅綠假單胞菌作為指示菌的最佳培養(yǎng)時期。

表4 不同生長時期對斜率、截距及決定系數(shù)的影響Table 4 Effects of different growth periods on slope，intercept and coefficient of determination

2.7 試驗驗證

通過對抗菌肽定量試驗進行優(yōu)化，得出以銅綠假單胞菌為指示菌，確定試驗的最優(yōu)條件為：指示菌的最佳培養(yǎng)時期為穩(wěn)定期，指示菌濃度為106cfu/mL，培養(yǎng)基厚度為3.15 mm（20 mL），瓊脂濃度為1.5%，在此條件下所得硫酸多粘菌素B的效價為8 043 U/mg，95%置信區(qū)間（4 256，15 539）。為進一步驗證試驗的可行性，選用硫酸多粘菌素B、桿菌肽和指示菌大腸桿菌分別進行試驗，結(jié)果見圖4、圖5、表5。

圖4 硫酸多粘菌素B抑制大腸桿菌試驗Fig.4 Inhibition to E.coli of polymyxin B

圖5 桿菌肽抑制大腸桿菌試驗Fig.5 Inhibition to E.coli of bacitracin

表5 試驗驗證Table 5 Test verification

試驗的精密度和重復(fù)性較好，并且計算得桿菌肽對大腸桿菌的效價為304 U/mg，95%置信區(qū)間為（268，345），且3次重復(fù)所得結(jié)果p>0.05，差異不顯著；硫酸多粘菌素B對大腸桿菌的效價為845 U/mg，95%置信區(qū)間（609，1172），3次重復(fù)所得結(jié)果 p>0.05，差異不顯著。結(jié)果表明，利用該方法定量測定抗菌肽效價的重復(fù)性好，精確度高，具有較強的適用性。

3 結(jié)論

通過對瓊脂擴散法進行優(yōu)化，得出其測定抗菌肽效價的最佳條件為：指示菌的最佳培養(yǎng)時期為穩(wěn)定期，濃度 106cfu/mL，培養(yǎng)基厚度 3.15 mm（20 mL），瓊脂濃度1.5%。使用銅綠假單胞菌進行試驗，所得結(jié)果穩(wěn)定性較高。通過對上述因素進行分析，指示菌菌齡、瓊脂糖的厚度對試驗有較大的影響，其斜率和截距的變異系數(shù)高，在進行試驗時需要嚴(yán)格控制。

藥典中采用管碟法對抗菌肽效價進行測定時必須具備生物標(biāo)準(zhǔn)品，而抗菌肽因組分不單一，在生物標(biāo)準(zhǔn)品制備和效價定義方面存在一系列的問題，應(yīng)用本試驗方法解決了抗菌肽因沒有標(biāo)準(zhǔn)品而測定方法不統(tǒng)一的問題。同時，藥典中的管蝶法為兩孔法，由于所采用的不同抗菌肽濃度的數(shù)值變異度小，致使結(jié)果穩(wěn)定性差。通過對本試驗最優(yōu)條件下的試驗數(shù)據(jù)采用藥典的方法進行處理，發(fā)現(xiàn)其斜率變異系數(shù)為4.4%，截距的變異系數(shù)為0.62%。此外，藥典中并未對影響試驗的瓊脂濃度、厚度，指示菌菌齡、接菌量進行控制[20]，因此理論上其對斜率和截距的變異系數(shù)更大。

該種測定方法使用成本低、試驗操作簡單，可以應(yīng)用在抗菌肽的相關(guān)研究領(lǐng)域，如企業(yè)生產(chǎn)、實驗室研究。通過不同抗菌肽的重復(fù)試驗也發(fā)現(xiàn)，該種方法具有一定的普適性，且重復(fù)性良好，為抗菌肽的進一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。當(dāng)然對于抗菌肽效價的測定只是抗菌肽應(yīng)用過程中亟需解決的關(guān)鍵問題之一，還有很多問題需要進一步試驗去了解。