支氣管哮喘急性發(fā)作期患者血小板線粒體功能變化及其與氧化應(yīng)激的相關(guān)性研究

劉慧芳，李風(fēng)森，姜敏，田戈

支氣管哮喘是一種以氣道慢性炎癥為主要特征的異質(zhì)性疾病，主要發(fā)病特點為不同程度氣道通氣受限、氣道高反應(yīng)、黏液分泌增多等，主要發(fā)病機制為活性氧蓄積及氧化應(yīng)激［1-2］?；钚匝醢ㄍ庠葱曰钚匝鹾蛢?nèi)源性活性氧，其中外源性活性氧主要包括吸煙﹑工業(yè)污染及汽車尾氣排放所含的氧化性氣體、臭氧、超微顆粒等；而內(nèi)源性活性氧主要由線粒體呼吸作用產(chǎn)生。動物實驗結(jié)果顯示，支氣管哮喘大鼠氣道組織中存在結(jié)構(gòu)破壞的線粒體，表現(xiàn)為線粒體嵴減少或消失，板層體和線粒體空泡形成［3］。筆者所在課題組推測支氣管哮喘患者線粒體改變可能是全身性的，而血小板取材非常方便，故觀察血小板線粒體變化具有一定可行性。本研究旨在探討支氣管哮喘急性發(fā)作期患者血小板線粒體功能變化及其與氧化應(yīng)激的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年4月—2017年5月新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院呼吸科門診及住院的支氣管哮喘急性發(fā)作期患者122例作為哮喘組，均符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組制定的《支氣管哮喘防治指南（2016年版）》［4］中的支氣管哮喘急性發(fā)作期診斷標準；另選取同期新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院體檢中心體檢健康者44例作為對照組。兩組受試者性別、年齡及體質(zhì)指數(shù)（BMI）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表1），具有可比性。所有受試者對本研究知情同意。

表1 兩組受試者一般資料比較Table 1 Comparison of general information between the two groups

1.2 排除標準 （1）年齡＜18周歲或＞65周歲者；（2）妊娠期或哺乳期婦女；（3）合并肺結(jié)核、肺纖維化及呼吸衰竭者；（4）合并惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；（5）合并精神病或精神異常者。

1.3 主要試劑與儀器

1.3.1 主要試劑 JC-1購自美國Sigma公司，血小板線粒體提取試劑盒（GMS10062.2VA）購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，三磷腺苷（ATP）檢測試劑盒（MAK190）購自Sigma公司，細胞色素C氧化酶（COX）活性檢測試劑盒（CYTOCOX1）購自Sigma公司，人8-異前列腺素（8-iso）酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自北京安迪華泰科技有限公司，人硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自北京安迪華泰科技有限公司，人過氧化脂質(zhì)（LPO）檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司，電鏡專用的5%戊二醛固定液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）購自Sigma公司。

1.3.2 主要儀器 酶標儀及分光光度計Thermo1500購自美國Thermo公司，熱恒溫培養(yǎng)箱（KD-8D）購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司，常溫離心機（Thermo Sorvall ST16）購自美國Thermo公司，流式細胞儀（Guava easyCyte 8HT）購自德國Merck公司，低溫離心機（Thermo LEGEND MICRO21）購自美國Thermo公司，高速冷凍離心機（Thermo BIOFUGE STRATOS）購自美國Thermo公司。

1.4 檢測方法

1.4.1 標本采集 留取體檢健康者及支氣管哮喘急性加重期患者停用吸入性糖皮質(zhì)激素后靜脈血18 ml，置于乙二胺四乙酸（EDTA）管中備用。

1.4.2 血小板線粒體功能指標

1.4.2.1 標本處理 從EDTA管中取1 ml全血置于2 ml EP管中，4 ℃于2 h內(nèi)分離血小板，檢測膜電位；另取1 ml全血置于2 ml EP管中，4 ℃于2 h內(nèi)分離血小板并置于-80 ℃環(huán)境下保存，檢測ATP；另取10 ml全血，4 ℃于2 h內(nèi)分離血小板并置于-80 ℃環(huán)境下保存，檢測COX活性。

1.4.2.2 分離血小板 全血在4 ℃環(huán)境下，2 000 r/min離心15 min，得到的上清即為富含血小板的血清，抽取上清至于另一1.5 ml EP管中；4 ℃、2 000 r/min離心15 min，棄上清；加入1 ml PBS混懸，4 ℃、2 000 r/min離心15 min后棄上清，此步驟重復(fù)兩次，得到的沉淀即為血小板。

1.4.2.3 膜電位 采用二甲基亞砜（DMSO）溶解JC-1，充分混勻濃度為1 μg/μl作為儲備液，并采用PBS稀釋至濃度為2.5 ng/μl的工作液，注意避光。流式管中加JC-1工作液2 μl、血小板混懸液200 μl、PBS 800 μl混勻，37 ℃孵育20 min后上流式細胞儀。觀察細胞數(shù)5 000個，F(xiàn)L1通道激發(fā)波長488 nm，散發(fā)波長530 nm，獲得黃色熒光，代表膜電位正常細胞；FL2通道激發(fā)波長488 nm，散發(fā)波長575 nm，獲得綠色熒光，代表膜電位損傷細胞。采用GUAVA軟件分析黃色熒光和黃色熒光比例即為膜電位。

1.4.2.4 ATP 采用ATP檢測試劑盒檢測線粒體ATP，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.2.5 COX活性 采用COX活性檢測試劑盒檢測線粒體COX活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.2.6 血小板超微結(jié)構(gòu) 經(jīng)差速離心法分離得到血小板沉淀，加入2.5%戊二醛固定液1 ml進行固定，立即送電鏡室行樹脂浸透、包埋，超薄切片，染色，采用透射電鏡觀察血小板超微結(jié)構(gòu)。

1.4.3 氧化應(yīng)激指標 從EDTA管中取余下全血約6 ml，3 500 r/min離心15 min，分裝于EP管中，-80 ℃環(huán)境下保存，分別采用人8-iso酶聯(lián)免疫分析試劑盒、人TBARS酶聯(lián)免疫分析試劑盒、人LPO檢測試劑盒檢測血清8-iso、TBARS、LPO水平，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計量資料以（x±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（QR）表示，采用秩和檢驗；計數(shù)資料分析采用χ2檢驗；支氣管哮喘急性期患者血小板線粒體功能指標與氧化應(yīng)激指標的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體功能指標 哮喘組患者血小板線粒體膜電位、ATP及COX活性低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。兩組受試者血小板線粒體膜電位流式細胞圖見圖1。

2.2 血小板超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡下，哮喘組患者血小板中可見細胞內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)增生，空泡形成增多，細胞基質(zhì)密度變小，有形細胞器數(shù)量減少，線粒體結(jié)構(gòu)不清晰（見圖2）；對照組受試者血小板中可見細胞內(nèi)有形結(jié)構(gòu)基本正常，未見空泡增多，細胞器清晰可見（見圖3）。2.3 氧化應(yīng)激指標 哮喘組患者血清8-iso、TBARS、LPO水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，支氣管哮喘急性期患者血小板線粒體膜電位與血清LPO水平呈負相關(guān)，血小板線粒體ATP與血清8-iso 、TBARS水平呈負相關(guān)，血小板線粒體COX活性與血清8-iso水平呈負相關(guān)（P＜0.05，見表3）。

表1 兩組受試者血小板線粒體膜電位、ATP、COX活性比較Table 1 Comparison of membrane potential，ATP and COX activity of platelet mitochondria between the two groups

圖1 兩組受試者血小板線粒體膜電位流式細胞圖Figure 1 Flow cytometry results for membrane potential of platelet mitochondria in the two groups

圖2 哮喘組患者血小板超微結(jié)構(gòu)圖Figure 2 Ultrastructural diagram of platelet in case group

圖3 對照組受試者血小板超微結(jié)構(gòu)圖Figure 3 Ultrastructural diagram of platelet in control group

表2 兩組患者血清8-iso、TBARS、LPO水平比較（x±s）Table 2 Comparison of serum levels of 8-iso，TBARS and LPO between the two groups

表3 支氣管哮喘急性發(fā)作期患者血小板線粒體功能指標與氧化應(yīng)激指標的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis on correlations of index of platelet mitochondrial function with index of oxidative stress in patients with acute attack of bronchial asthma

3 討論

肺部解剖學(xué)組織結(jié)構(gòu)特殊，可同時受到內(nèi)源性活性氧和外源活性氧的威脅。外源性活性氧可導(dǎo)致氣道功能損傷，誘發(fā)哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病，但當(dāng)疾病及病理狀態(tài)形成后，即使阻斷外源性活性氧的來源（如戒煙）也無法停止活性氧的持續(xù)存在及其對組織的氧化損傷［3，5］，故猜測此時持續(xù)存在的威脅可能是由內(nèi)源性活性氧引起，而線粒體呼吸作用是內(nèi)源性活性氧的最主要來源。

線粒體是一種獨立細胞器，是氨基酸、糖、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)進行氧化并釋放能量的場所，其主要功能是氧化磷酸化、合成ATP、提供直接能量，并參與鈣離子信號傳導(dǎo)、影響能量代謝和細胞凋亡，是自由基產(chǎn)生的主要來源，機體95%的活性氧來源于細胞線粒體［6-7］。線粒體功能異常主要由于線粒體數(shù)量減少、膜破壞、呼吸鏈抑制、酶活性降低、線粒體DNA（mtDNA）損傷等引起能量代謝障礙、活性氧產(chǎn)生，進而導(dǎo)致一系列損傷。生理情況下，蛋白質(zhì)、脂肪、糖等物質(zhì)在細胞質(zhì)中降解后可進入線粒體，經(jīng)三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的氫離子會進入線粒體內(nèi)膜，在電子傳遞鏈（呼吸鏈）COX作用下，與氧分子結(jié)合并進行氧化還原反應(yīng)生成水和ATP；但當(dāng)線粒體受損、功能障礙時，COX活性降低、呼吸鏈抑制，1個或2個電子轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致氧化磷酸化過程異常，氧化還原反應(yīng)不完全而引起超氧陰離子等活性氧自由基過度產(chǎn)生，造成活性氧蓄積及ATP合成減少，進而促發(fā)炎性反應(yīng)［8］。既往研究結(jié)果顯示，線粒體功能障礙可能參與氣道上皮損傷及哮喘的發(fā)生［9-13］。

任何外源性或內(nèi)源性病理因素均會導(dǎo)致呼吸鏈內(nèi)COX活性降低，呼吸鏈抑制后氧化磷酸化反應(yīng)和氧代謝異常，ATP釋放減少及活性氧、自由基釋放增加等。COX活性可反映線粒體呼吸鏈功能。膜電位是指細胞膜內(nèi)外電位差，當(dāng)ATP釋放減少時細胞膜內(nèi)外離子濃度發(fā)生改變，進而導(dǎo)致膜電位下降。此外，線粒體功能還與線粒體數(shù)量有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，哮喘組患者血小板線粒體膜電位、ATP及COX活性低于對照組；且哮喘組患者血小板內(nèi)線粒體等細胞器數(shù)量減少，細胞基質(zhì)密度變小，空泡形成增多，提示支氣管哮喘急性發(fā)作期患者血小板線粒體功能損傷，主要表現(xiàn)為呼吸鏈抑制，且呼吸鏈抑制可導(dǎo)致內(nèi)源性活性氧增加，進而引發(fā)支氣管哮喘。

8-iso是氧化應(yīng)激的重要生物標志物。TBARS則涵蓋了大部分氧化損傷產(chǎn)生的全酮類物質(zhì)，故被作為衡量氧化應(yīng)激的有效指標。LPO是體內(nèi)細胞膜結(jié)構(gòu)中的多介不飽和脂肪酸受到氧自由基作用生成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。本研究結(jié)果顯示，哮喘組患者血清8-iso、TBARS、LPO水平高于對照組，與既往研究結(jié)果相一致［1-2］，提示哮喘患者存在氧化應(yīng)激。為了進一步探究線粒體功能損傷引起哮喘的可能機制，本研究進一步行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，支氣管哮喘急性發(fā)作期患者血小板線粒體膜電位水平與血清LPO水平呈負相關(guān)，血小板線粒體ATP與血清8-iso、TBARS水平呈負相關(guān)，血小板線粒體COX活性與血清8-iso、LPO水平呈負相關(guān)，提示支氣管哮喘急性發(fā)作期患者血小板線粒體功能損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)。

綜上所述，支氣管哮喘急性發(fā)作期患者存在血小板線粒體功能損傷，主要表現(xiàn)為呼吸鏈抑制，且血小板線粒體功能損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)，對探究支氣管哮喘的發(fā)病機制具有一定參考價值。但本研究樣本量較小，且尚不能明確血小板線粒體功能損傷與氧化應(yīng)激的因果關(guān)系；此外，線粒體抗氧化劑可能為支氣管哮喘的治療提供新的思路，均有待進一步研究探討。

作者貢獻：李風(fēng)森進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析，負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理；劉慧芳、姜敏、田戈進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；劉慧芳、姜敏進行結(jié)果分析與解釋；劉慧芳負責(zé)撰寫論文。

本文無利益沖突。