不同品系成年小鼠乳腺干細(xì)胞差異分析

尹曉瑩，高慧，孫曉偉，黃長(zhǎng)江*

(溫州醫(yī)科大學(xué) a 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，b 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

乳腺是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的器官，在青春期、月經(jīng)周期、懷孕、哺乳和絕經(jīng)等過(guò)程中，組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)會(huì)發(fā)生很大變化。乳腺中存在著嚴(yán)格的等級(jí)結(jié)構(gòu)，正常的乳腺上皮細(xì)胞可以根據(jù)細(xì)胞的特性和在導(dǎo)管中的位置分為組成導(dǎo)管內(nèi)側(cè)面的管腔上皮細(xì)胞和組成導(dǎo)管外側(cè)面與基底膜相鄰的基底細(xì)胞[1]。干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新復(fù)制及多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞，處于乳腺細(xì)胞等級(jí)的最頂級(jí)。祖細(xì)胞往往具有某種特定的細(xì)胞分化潛能但失去了自我更新能力，能夠分化形成1種或幾種低等級(jí)細(xì)胞。乳腺上皮細(xì)胞的這種多層次結(jié)構(gòu)可以大大減少干細(xì)胞及祖細(xì)胞為維持乳腺組織的周期性變化而產(chǎn)生的消耗。乳腺是一個(gè)高度再生的器官，可以通過(guò)乳腺干細(xì)胞來(lái)調(diào)控乳腺增生、泌乳和復(fù)舊等周期性變化[2]。乳腺干細(xì)胞作為調(diào)控乳腺發(fā)育的重要部分，是乳腺癌細(xì)胞起源研究的焦點(diǎn)。自Dontu等[3]研究發(fā)現(xiàn)在人乳腺中存在一小群具有自我更新和分化能力的細(xì)胞之后，乳腺干細(xì)胞開(kāi)始逐漸進(jìn)入人們的視野。

長(zhǎng)久以來(lái)，人們一直在尋找確定干細(xì)胞的方法，目前已有一些分子作為干細(xì)胞的標(biāo)志物，但其特異性還有待研究[4]。3D細(xì)胞培養(yǎng)又稱(chēng)三維細(xì)胞培養(yǎng)，指在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中提供一個(gè)接近體內(nèi)生存條件的微環(huán)境，使細(xì)胞處于更加接近人體或者動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境中生長(zhǎng)[5]，一般用來(lái)驗(yàn)證干細(xì)胞的自我更新和分化能力。本試驗(yàn)用乳腺干細(xì)胞富集的標(biāo)志物篩選乳腺干細(xì)胞，后用3D細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)驗(yàn)證乳腺干細(xì)胞的功能。

據(jù)2011年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)道，在女性中發(fā)病率和死亡率高居首位的是乳腺癌[6]，而與之相關(guān)的乳腺形態(tài)結(jié)構(gòu)變化以及乳腺干細(xì)胞組成功能差異則成為了研究的熱點(diǎn)[7-9]。實(shí)驗(yàn)小鼠由于生產(chǎn)繁殖快，成本低，易觀察，平行性好且基因組與人類(lèi)基因組有較高同源性，被廣泛用作乳腺癌的模式生物。

目前已培育出的實(shí)驗(yàn)小鼠品系有很多，且各有特點(diǎn)。C57BL/6和Balb/c小鼠是應(yīng)用較廣泛的2個(gè)近交系小鼠，ICR小鼠是國(guó)際通用的封閉群小鼠，但在乳腺方面比較小鼠品系的差異尤其是比較不同品系小鼠的乳腺干細(xì)胞比例等方面差異的研究還比較少。本研究選擇以C57BL/6、Balb/c以及ICR小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究不同品系小鼠乳腺形態(tài)和乳腺干細(xì)胞組成方面的差異，從而為乳腺干細(xì)胞3D培養(yǎng)的濃度選擇提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

成年C57BL/6、Balb/c，以及ICR小鼠(3～5月齡)購(gòu)自北京維通利華技術(shù)有限公司，在動(dòng)物房SPF潔凈條件下飼養(yǎng)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照學(xué)校動(dòng)物管理中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)則進(jìn)行飼養(yǎng)。乳腺組織采集以及后續(xù)無(wú)菌操作均在生物安全柜中進(jìn)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱和生物安全柜購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.1.3 試劑耗材

胭脂紅和硫酸鉀鋁購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Epicult-B基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Epicult-B Proliferation Supplement、Mammocult 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Mammocult Proliferation supplement和乳腺上皮細(xì)胞富集試劑盒、氯化銨溶液、Trypsin-EDTA (0.25%)、DNase I、Dispase/抗鼠CD24-FITC抗體和抗人/鼠CD49f-PE購(gòu)自加拿大Stem Cell公司；Streptavidin-APC抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；基底膜基質(zhì)購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠乳腺組織采集

小鼠用異氟烷麻醉后，頸椎脫臼處死。將處死的小鼠用70%酒精消毒后，在生物安全柜中腹部向上固定，用外用手術(shù)刀剪開(kāi)外皮，用內(nèi)用手術(shù)剪刀取下腹股溝處和胸腺處乳腺，備用。

1.2.2 小鼠乳腺整體染色

采集到的乳腺放在載玻片上攤平后放入配置好的染色固定液中，用胭脂紅染液染色過(guò)夜，脫水封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 細(xì)胞流式分選

將采集到的乳腺放到消化液后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化，依次加入氯化銨、胰蛋白酶和Dnase Ⅰ處理，得到單細(xì)胞懸液。分別加入不同熒光素標(biāo)記的cocktail、Streptavidin-APC、CD24-FITC、CD49f-PE抗體，分選得到基底干細(xì)胞群(Lin-CD24+CD49fhi)和管腔干細(xì)胞群(Lin-CD24hiCD49flo)。

1.2.4 3D細(xì)胞培養(yǎng)

將流式分選得到的不同細(xì)胞群按照不同的濃度重懸于基底膜基質(zhì)中，接種于12孔板中，待膠凝固后加入含有血清的培養(yǎng)基，8～9 d補(bǔ)加相同培養(yǎng)基，15 d后觀察并記錄3D結(jié)構(gòu)的形態(tài)和大小。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*，**，***分別表示在5%、1%、0.1%水平上差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺形態(tài)的差異

如圖1所示，C57BL/6和Balb/c小鼠乳腺具有完整清晰的二級(jí)和三級(jí)分支結(jié)構(gòu)，但I(xiàn)CR小鼠二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)異常，且淋巴結(jié)面積增大。

圖1 不同品系小鼠乳腺形態(tài)差異(1 000×)

2.2 乳腺干細(xì)胞組成的差異

對(duì)采集的小鼠乳腺組織進(jìn)行消化，借助于不同的細(xì)胞表面抗原(CD24和CD49f)[10]，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后得到2個(gè)細(xì)胞亞群，分別為基底干細(xì)胞富集的群(Lin-CD24+CD49fhi)和管腔干細(xì)胞富集的群(Lin-CD24hiCD49flo)。由圖2可以看出，3個(gè)品系小鼠管腔干細(xì)胞所占比例以及管腔干細(xì)胞和基底干細(xì)胞的比均無(wú)顯著差異，但I(xiàn)CR小鼠基底干細(xì)胞所占比例增加。

2.3 3D形成率的差異

流式分選出的細(xì)胞按照不用的濃度接種于基底膜基質(zhì)中可形成3D結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計(jì)每1 000個(gè)細(xì)胞形成的3D數(shù)(圖3)。研究發(fā)現(xiàn)，不管是基底干細(xì)胞還是管腔干細(xì)胞，Balb/c小鼠的3D形成率均顯著高于另外兩個(gè)品系小鼠。

2.4 3D直徑和形態(tài)的差異

基底干細(xì)胞形成的3D多為實(shí)心結(jié)構(gòu)，管腔干細(xì)胞形成的3D多為空心結(jié)構(gòu)[11]。對(duì)形成的3D直徑進(jìn)行測(cè)量，同時(shí)記錄空心以及實(shí)心結(jié)構(gòu)所占比例(圖4)。結(jié)果顯示，Balb/c小鼠形成的3D直徑以及結(jié)構(gòu)與另外2個(gè)品系都有差異。

圖2 不同品系小鼠乳腺干細(xì)胞組成差異

圖3 不同品系小鼠乳腺干細(xì)胞3D形成率差異

圖4 不同品系小鼠乳腺干細(xì)胞3D直徑及形態(tài)差異

3 討論

實(shí)驗(yàn)小鼠廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、心理學(xué)等領(lǐng)域[12-13]，目前已育成1 000多種近交系和獨(dú)立的遠(yuǎn)交群，可根據(jù)不同需要選擇不同品系小鼠。C57BL/6小鼠屬于近交系，是第一種擁有全基因組測(cè)序的小鼠，具有乳腺腫瘤和卵巢瘤自然發(fā)生率低且化學(xué)物質(zhì)難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤等特點(diǎn)，經(jīng)常被用來(lái)進(jìn)行腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)等方面的研究。Balb/c小鼠的遺傳背景為近交系，由親兄弟姐妹遺傳繁殖，因而遺傳基因更純，乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，但用乳腺腫瘤病毒誘發(fā)時(shí)發(fā)病率高[14]，卵巢、腎上腺和肺部的腫瘤在該小鼠有一定的發(fā)生率。ICR小鼠屬于遠(yuǎn)親雜交群，具有繁殖力好，對(duì)疾病的抵抗力強(qiáng)的特點(diǎn)，主要被用于安全評(píng)價(jià)、藥理學(xué)、毒理學(xué)和感染免疫等試驗(yàn)中。

在使用誘癌劑來(lái)建立誘發(fā)性乳腺癌動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌的發(fā)生是通過(guò)乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞增生、非典型性增生、癌變，進(jìn)而演變成為乳腺癌的動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行的[15-16]。乳腺導(dǎo)管結(jié)構(gòu)異?？赡苁侨橄俳M織發(fā)生病變的參考因素之一。通過(guò)乳腺整體染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C57BL/6和Balb/c小鼠乳腺導(dǎo)管形態(tài)沒(méi)有差異，但I(xiàn)CR小鼠乳腺導(dǎo)管形態(tài)異常，沒(méi)有明顯的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，且淋巴結(jié)面積增大，表明ICR小鼠較易引起炎癥反應(yīng)，ICR小鼠的穩(wěn)定性低于C57BL/6和Balb/c小鼠。

通過(guò)對(duì)比3個(gè)品系乳腺干細(xì)胞3D形成率的差異，從而篩選出12孔板形成3D所需細(xì)胞的最適濃度。對(duì)于基底干細(xì)胞來(lái)說(shuō)，C57BL/6小鼠3D種植最適濃度為每孔30 000個(gè)細(xì)胞，Balb/c小鼠為每孔5 000個(gè)細(xì)胞，ICR小鼠為每孔20 000個(gè)細(xì)胞。對(duì)于管腔干細(xì)胞來(lái)說(shuō)，C57BL/6小鼠3D種植最適濃度為每孔500個(gè)細(xì)胞，Balb/c小鼠為每孔500個(gè)細(xì)胞，ICR小鼠為每孔1 000個(gè)細(xì)胞。Balb/c小鼠不管是基底干細(xì)胞還是管腔干細(xì)胞都較易形成3D，C57BL/6小鼠管腔干細(xì)胞較易形成3D結(jié)構(gòu)，ICR小鼠與C57和Balb/c小鼠相比，乳腺干細(xì)胞形成3D能力相對(duì)較弱。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)不同品系小鼠乳腺干細(xì)胞克隆形成率不同，即不同品系小鼠乳腺干細(xì)胞自我更新和分化能力不同，這與我們的觀點(diǎn)不謀而合。

在乳腺干細(xì)胞形成的3D結(jié)構(gòu)中，C57BL/6和Balb/c小鼠特別是Balb/c小鼠，管腔干細(xì)胞形成的實(shí)心結(jié)構(gòu)較多，推測(cè)可能是空心的3D結(jié)構(gòu)長(zhǎng)實(shí)了。Lim等[18-19]的研究證明基底細(xì)胞樣乳腺癌來(lái)源于管腔干細(xì)胞，本研究發(fā)現(xiàn)，管腔干細(xì)胞可以形成基底干細(xì)胞形成的實(shí)心樣3D結(jié)構(gòu)，這就為管腔干細(xì)胞形成基底樣乳腺癌提供了可能。

ICR小鼠作為一個(gè)遠(yuǎn)交品系，雖然有其優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于乳腺及其相關(guān)研究有一定的局限性，選用C57BL/6和Balb/c小鼠較好。不同品系小鼠其形成3D的能力差異較大，應(yīng)選擇最適細(xì)胞濃度，但這種差異的產(chǎn)生機(jī)制仍需我們進(jìn)一步探索。