UPLC-MS/MS快速測定血漿中抗癲癇藥物方法研究

麻佳蕾 許東航 陳菲（通訊作者） 吳筱丹

（1金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院 浙江 金華 321000）

（2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310052）

癲癇是臨床常見的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病[1]，常用抗癲癇藥物有苯巴比妥、苯妥英鈉和丙戊酸鈉等，且多為肝藥酶誘導(dǎo)劑，多種抗癲癇藥物聯(lián)用則存在藥物血藥濃度增加或降低，從而帶來多種不良反應(yīng)[2-3]。本研究擬用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析技術(shù)，建立快速檢測人血漿中苯妥英鈉和丙戊酸鈉濃度的方法，為該類藥物的個體化給藥方案的制定、臨床藥物中毒判斷等提供幫助。

1.材料與方法

1.1 儀器與試劑

所用儀器Agilient 6460三重串聯(lián)四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀；對照品：苯妥英鈉（100210-201002）、丙戊酸鈉（100963-201302），純度：99.8%，均由中國食品藥品檢定所提供。

1.2 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1×50mm，1.8μm），流動相為10mM醋酸銨和乙腈梯度洗脫，流速0.3ml/min，柱溫40℃，進樣量2μl。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，離子源溫度120℃，用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。苯妥英鈉和丙戊酸鈉Frag分別為70，16V，CE分別為12，18V，檢測的離子對分別為m/z251.2→251.2，m/z143→143，負離子掃描分析。

1.4 標準溶液配制方法

配制藥物對照品的混合儲備液，在200μl空白血漿中，精密加入10μl對照品混合溶液，配制得對照液標準濃度范圍見表1。標準溶液范圍為 0.2μg?mL-1～ 20μg?mL-1。

1.5 血漿樣品處理方法

量取血漿樣品200μL，置于1.5mL塑料離心管中，渦旋混合30s，加入甲醇800μL，渦旋混合60s，4℃、1×104rpm離心30min，取上清液，進樣2μL。

2.方法學(xué)考察

2.1 專屬性

取6個不同來源的人空白血漿樣品，混合均勻后取200μL，加入甲醇500μL，按血漿樣品處理并進樣分析。另配制苯妥英鈉和丙戊酸鈉質(zhì)控血漿樣品，得到空白血漿添加對照品色譜圖，結(jié)果待測物峰形良好，分離效果佳，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對待測物無干擾，保留時間分別為3.363和3.730min。

2.2 標準曲線與最低檢出限

分別稱取苯妥英鈉和丙戊酸鈉對照品適量，各加入甲醇，制成10.0mg?mL-1儲備液。精密量取適當?shù)臉藴蕛湟?，制成系列混合對照品溶液。?00μL空白血漿中加入10μL混合對照品溶液，制成系列的質(zhì)控血漿樣品。按“1.5”項操作，以待測物質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，待測物峰面積(Y)為縱坐標，其加權(quán)(1/X)線性回歸后，得回歸方程分別為：Y=2222.87X-49.88（R2=0.9984）；Y=121.17X-11.10（R2=0.9993）。

2.3 精密度和提取回收率

取空白人血漿，配制3個低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，按血漿樣處理方法進行處理。每質(zhì)量濃度5份同日測定，連續(xù)測定3d。當日的隨行標準曲線計算樣品的測定質(zhì)量濃度，與配制的質(zhì)量濃度對照，得方法回收率。將質(zhì)控樣品的峰面積計算RSD，考察方法的日內(nèi)、日間精密度，數(shù)值均＜15%，回收率均＞80%，結(jié)果見表1。

表1 抗癲癇藥物的精密度和回收率

2.4 穩(wěn)定性

考察抗癲癇藥物化合物在低、中、高質(zhì)量濃度分別于室溫24℃放置8h、-20℃放置30天、-20℃反復(fù)凍融3次、處理后待測樣品在儀器自動進樣室10℃12h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果峰面積RSD值均小于10%。

3.分析與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

為獲得較好的色譜峰峰形、較短的分析時間和較高的質(zhì)譜響應(yīng)信號，曾選擇 0.1%的甲酸水溶液-乙腈、5mmol?L-1乙酸銨水溶液-甲醇及10mmol?L-1乙酸銨水溶液-甲醇作為流動相。結(jié)果以甲醇-5mmol?L-1乙酸銨為流動相梯度洗脫，回收率高，檢測靈敏度最佳。

3.2 方法學(xué)應(yīng)用

對服用抗癲癇藥物的臨床病人血液樣本進行了分析，原檢測報告單采用的是免疫發(fā)光法進行檢測。具體檢測結(jié)果見表2。

用本項目研究的UPLC-MS/MS方法與免疫發(fā)光法的結(jié)果基本一致。在病例樣本檢測出了丙戊酸鈉的濃度。而在原來的分析報告中，未列出丙戊酸鈉檢測要求，因此在報告中未檢測，導(dǎo)致臨床診斷與病人的實際用藥情況不想符合。

表2 服用抗癲癇藥物的臨床病人血漿樣本檢測結(jié)果（μg?mL-1）