黃土高原不同種植年限紫花苜蓿根系分泌物GC-MS分析

畢博遠， ,2*

(1. 西北農林科技大學 資源環(huán)境學院， 陜西 楊凌712100；2. 西北農林科技大學黃土高原土壤侵蝕與旱地農業(yè)國家重點實驗室， 陜西 楊凌712100)

根系作為植物與土壤的接觸面，不僅是吸收和代謝器官，同時也是強大的分泌器官[1]。根系分泌物是植物與土壤進行物質交換和信息傳遞的重要載體物質, 是植物響應外界脅迫的重要途徑, 是構成植物不同根際微生態(tài)特征的關鍵因素, 也是根際對話的主要調控者[2]。根系分泌物對于生物地球化學循環(huán)、根際生態(tài)過程調控、植物生長發(fā)育等均具有重要功能, 尤其是在調控根際微生態(tài)系統(tǒng)結構與功能方面發(fā)揮著重要作用，調節(jié)著植物-植物、植物-微生物、微生物-微生物間復雜的互作過程[3]。已有的多數(shù)研究[4-7]，僅是針對草地地表的研究，其中根系密度、直徑、比表面積、根重以及根冠比等指標通長是研究的主要方向，而對表層以下的研究相對較少，因此有關根系方面地下部分需要進一步研究。

國內外學者利用不同的提取方式提取各種植物的根系分泌物，大致分為水培、土培、基質培養(yǎng)這三種方法。從植物的根際土壤中提取分泌物(土培)，是最接近于植物自然生長狀態(tài)的提取方法，相比于水培收集法，這種方法最大的優(yōu)點是更能反映植株在土壤中的實際分泌情況，而且由于土壤存在機械阻力，根系分泌作用比較旺盛，土培條件下單位植株干重產生根系分泌物的量要高于溶液培養(yǎng)收集的根系分泌物量[8]。雖然這種方法相較于水培條件易受土壤微生物分解的干擾，但可以反映在自然生長條件下植物根系分泌的真實情況，這對于了解植物根系分泌物組成具有重要意義。目前，相對來說比較完善的測試技術是采用氣象色譜質譜聯(lián)用儀(GC-MS)對根系分泌物進行分析。本研究通過采集不同種植年限(1年、10年、20年、30年)紫花苜蓿‘中苜一號’的根際土壤，用不同極性的浸提劑(二氯甲烷、乙酸乙酯)提取苜蓿根際土壤根系分泌物，初步明確不同年限其組分含量和典型分泌物間的差異，以期為研究植物-土壤養(yǎng)分互作過程提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)域

本研究采用的紫花苜蓿根系來自于中國科學院水土保持研究所神木生態(tài)觀測站不同種植年限的‘中苜一號’人工小區(qū)，該站位于神木縣以西14 km處的六道溝流域，北靠長城，地處毛烏素沙漠的邊緣，屬于黃土高原水蝕風蝕交錯帶的強烈侵蝕中心，流域面積6.7 km2。該流域基本養(yǎng)分特征是普遍缺氮，部分缺磷、鉀素比較豐富。依據土壤養(yǎng)分分級標準，該流域的三大用地(農地、草地、林地)含氮量均處于第6級，速效磷含量農用地處于 2 級，草地和林地處于 4 級，有機質含量處于 4～6 級[9]。

1.2 根際土壤的采集

挖取長勢相同且無病蟲害的苜蓿根系，根際土壤的采集參照盧豪良等[10]的方法，即先抖落表面土壤，用毛刷輕輕刷掉緊貼根面的大約5 mm的土壤，裝入密封袋中，冷藏。

1.3 根系分泌物的提取

將所采集到的根際土壤研磨過0.25 mm篩，將上述4種種植年限的根際土壤分別稱取5 g置于離心管中，每種年限各取三組作為重復，分別加入50 ml二氯甲烷(乙酸乙酯)，于30℃的溫度震蕩1 h，再以4℃、5 000 r·min-1的條件離心10 min，取上清液并用0.45 μm濾膜過濾，最后用真空旋轉蒸發(fā)儀于40℃條件下將其減壓濃縮至3～5 ml，冷藏于-20℃冰箱，用于GC-MS測定。

1.4 GC-MS分析條件

氣相色譜儀：津島GC-MSQP 2010型氣象色譜質譜聯(lián)用儀。GC-MS Solution色譜工作站，標準譜庫為美國NIST質譜檢索數(shù)據庫。GC-MS分析條件主要根據相關參考文獻[11-16]執(zhí)行。GC條件：色譜柱：Rtx-5ms (30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：He；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：80℃；進樣口溫度：250℃；升溫程序：80℃為起始,以15 ℃·min-1升溫至200℃，以8 ℃·min-1升溫至250℃，保持18分鐘。進樣量：1 μL，不分流。MS條件：離子源溫度：230℃；電離方式：EI；電子能量：70eV；溶劑延遲時間：2.5 min；質量掃描范圍：10～450 amu；采集方式：SCAN掃描。

1.5 數(shù)據分析

本研究采用Excel和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

經GC-MS分析，將相似度在80%以上的物質進行了對比，并得到根系分泌物的總離子流圖見圖1與圖4。

2.1 二氯甲烷組分GC-MS鑒定結果

結合圖1與表1所示，在二氯甲烷提取的組分中，種植1年苜蓿共檢測出29種化合物，主要有烷烴類26種、脂類1種、醇類1種、酚類1種，其中烴類得相對含量較大，相對含量為82.20%，鄰苯二甲酸二乙酯所占比例為3.39%，這是除了烴類物質所含最多的其他化合物；種植10年苜蓿共檢測出34種化學物，主要有烷烴類26種、脂類4種、醇類3種，酸類1種，其中烷烴類的相對含量較大，相對含量為79.71%，在烷烴類物質中，二十一烷占其比例為30.63%、四十烷所占比例為14.62%、三十五烷所占比例為12.62%；種植20年苜蓿共檢測出33種化學物，其中烷烴類28種、脂類2種、醇類2種、酚類1種，烷烴類的相對含量為76.27%，在烷烴類物質中，二十一烷所占比例為36.54%、四十烷所占比例為24.88%；種植30年苜蓿共檢測出39種化學物，其中烷烴類31種、脂類3種、醇類1種、酚類1種、酸類2種、醚類1種，烷烴類的相對含量為82.1%，其中二十一烷所占烷烴類化合物的比例為32.55%。

圖1 二氯甲烷提取四種種植年限苜蓿根系分泌物GC-MS圖譜Fig.1 GC-MS map of root exudates of alfalfa in four planting years using dichloromethane

如圖2所示，在每種種植年限中烷烴所占比重較大，都占75%以上，可推測出由二氯甲烷提取的苜蓿根際土壤中典型根系分泌物是一些烷烴類化合物，且隨著種植年限的增長烷烴類化合物的種類逐年增多。此外，每種年限的根際土壤中我們還提取到少量的非烷烴類化合物。圖2顯示，在種植年限1年的苜蓿根系土壤中，提取到的化合物種類最少， 10年與20年的數(shù)量接近，而30年提取到的化合物種類最多。

圖2 二氯甲烷提取不同種植年限苜蓿根系分泌物化合物種類與數(shù)量Fig.2 The types and quantities of root exudates of different planting years’ alfalfa extracted fromdichloromethane注：不同小寫字母表示各年限化合物數(shù)量間差異達到顯著水平(P<0.05)Note：The different lowercase letters indicate that the number of compounds in different years has reached a significant level at the 0.05 level

如圖3所示，本研究選取了五種種植年限共同提取到的且相對含量較大的6種化合物，在20年苜蓿中，除二十一烷以外四十烷的含量顯著高于其他年限(P<0 .05)，同時三十六烷的含量也顯著高于其他年限(P<0.05)。由表1可知，30年苜蓿根系分泌物無論從化合物種類與數(shù)量來講都相對分泌比較旺盛，但僅二十一烷的相對含量顯著高于其他年限。并且，除了1年苜蓿以外各年限的紫花苜蓿二十一烷含量都占比很大，且呈現(xiàn)出相對含量逐年顯著遞增的趨勢(P<0.05)，這可能說明二十一烷是‘中苜一號’的典型分泌物。

圖3 二氯甲烷提取四種年限苜蓿根系分泌物共有組分Fig.3 Common components of dichloromethane extractionof four years of alfalfa root exudates注：不同小寫字母表示各年限化合物相對含量間差異達到顯著水平(P<0.05)Note：The different lowercase letters indicate that the relative content of compounds in different years has reached at the 0.05 level

表1 二氯甲烷提取四種種植年限苜蓿根系分泌物主要組分Table 1 Main components of dichloromethane extraction of four planting years Alfalfa root exudates

注：同行不同小寫字母表示各年限分泌物質相對含量間差異達到顯著水平(P<0.05)

Note：The different lowercase letters in the same row indicate that the relative content of secreted substances in different years has reached at the 0.05 level

2.2 乙酸乙酯組分GC-MS鑒定結果

結合圖4與表2所示，乙酸乙酯提取的組分中，種植1年苜蓿共檢測出11種化合物，主要有烴類10種、酮類1種，烴類幾乎占據全部，相對含量為99.66%，而乙烯酮的相對含量僅為0.41%；種植10年苜蓿共檢測出17種化學物，主要有烴類15種、醇類1種，酸類1種，烷烴類的相對含量較大，相對含量為94.2%，在烴類物質中，二十一烷占其比例為22.49%、三十六烷所占比例為20.43%、二十五烷所占比例為14.64%；種植20年苜蓿共檢測出18種化學物，其中烴類16種、酸類1種、醇類1，烴類的相對含量為95.97%，在烴類物質中，二十一烷所占比例為46.44%、四十烷所占比例為21.92%；種植30年苜蓿共檢測出41種化學物，其中烴類30種、脂類5種、醇類3種、酸類3種，烴類的相對含量達到了90.2%。其中二十一烷所占烴類化合物的比例為33.25%。

表2 乙酸乙酯提取四種種植年限苜蓿根系分泌物主要組分Table 2 Main components of ethyl acetate extraction of four planting years Alfalfa root exudates

注：同行不同小寫字母表示各年限分泌物質相對含量間差異達到顯著水平(P<0.05)

Note：The different lowercase letters in the same row indicate that the relative content of secreted substances in different years has reached at the 0.05 level

如圖5所示，在每種種植年限中烷烴所占比重較大，都占90%以上，可推測出由乙酸乙酯提取的苜蓿根際土壤中典型根系分泌物也是一些烷烴類化合物，且隨著種植年限的增長烷烴類化合物的種類逐年增多，并且30年的提取結果顯著高于其他年限(P<0.05)。由表2所示，在種植年限1年的苜蓿根系土壤中，提取到的化合物種類僅兩種且99.66%是烷烴，10年比20年提取到的化合物種類稍多，而30年提取到的化合物種類最多。此外，在30年的提取結果中酸類、醇類、脂類化合物均顯著高于其他年限(P<0.05)。

圖5 乙酸乙酯提取不同種植年限苜蓿根系分泌物化合物種類與數(shù)量Fig.5 The types and quantities of root exudates of different planting years’ alfalfa extracted from ethyl acetate注：不同小寫字母表示各年限化合物數(shù)量間差異達到顯著水平(P<0.05)Note：The different lowercase letters indicate that the number of compounds in different years has reached at the 0.05 level

如圖6所示，本研究選取了4種種植年限共同提取到的且相對含量較大的4種化合物，包括二十烷、二十一烷、三十六烷和四十烷。這與二氯甲烷提取結果相似，很可能說明這幾種物質是‘中苜一號’的 典型分泌物，并且二十一烷的相對含量在各年限中都處于優(yōu)勢地位，并隨著年限增長相對含量逐年顯著增加(P<0.05)。

3 討論

圖6 乙酸乙酯提取四種年限苜蓿根系分泌物共有組分Fig.6 Common components of ethyl acetate extraction of four years of alfalfa root exudates注：不同小寫字母表示各年限化合物相對含量間差異達到顯著水平(P<0.05)Note：The different lowercase letters indicate that the relative content of compounds in different years has reached at the 0.05 level

在一定的時間和空間條件下，植物根系分泌物發(fā)生的變化可能與土壤環(huán)境、氣候環(huán)境以及其他物種入侵有重要關系。首先，根際土壤環(huán)境主要分為土壤微生物活性、土壤酶活性和土壤的相關理化性質等因素。根際微生物的存在可大大促進根系分泌物的釋放，它可以通過改變根際營養(yǎng)狀況、植物體內激素含量來改變植物體內生理生化過程，從而影響根系分泌物的種類和數(shù)量[16]；根際微生物所產生的酶會礦化分解土壤中的有機物質，提高根際土壤的養(yǎng)分有效性，與此同時可能會造成養(yǎng)分脅迫以及影響植物光合作用等，從而影響根系分泌物的分泌與種類。張炳學等[17]對4種年限苜蓿草地剖面深度為0～40 cm的土壤微生物活性進行測定后發(fā)現(xiàn)，土壤PLFA(磷脂脂肪酸)總量和細菌、真菌、G+、G-、放線菌等其他菌群PLFA含量在0～20 cm土層中，均以10年苜蓿樣地土壤中PLFA含量最高；20～40 cm土壤深度中，1年、10年和20年樣地土壤中各PLFA含量均較高。本研究在提取到的10～40 cm剖面深度的苜蓿根際土壤GC-MS結果顯示，10年、20年苜蓿的化合物種類與數(shù)量均與1年、30年苜蓿存在較大差異。這說明各年限苜蓿草地中微生物作用的差異性對其根系分泌產生了重要的影響。根際土壤是植物生長的微環(huán)境，土壤溫濕度、土壤水分等理化性質都對根系分泌物產生影響。土壤中含水量的缺豐影響著根系的分泌情況，因為水分脅迫會造成某些植物根系分泌較多的有機酸。植物的根際土壤結構不同，尤其是土壤通透性不同，空氣通透性好的土壤的氧化還原電位明顯好于通透性低的土壤，進而導致某些金屬離子元素被活化然后毒害土壤，造成逆境脅迫從而影響根系分泌物的種類和數(shù)量。植被演替和其他物種入侵同樣是影響根系分泌物重要原因。從提取結果可知，用兩種浸提劑提取不同種植年限的紫花苜蓿根系分泌物， 30年苜蓿提取到的有機物種類和數(shù)量都明顯多于其他年限。因為隨著時間推移，人工苜蓿草地有3個階段的演替過程，1～10年的人工草地基本以苜蓿為主，在生長的10～30年苜蓿人工草地，長芒草會逐漸成為優(yōu)勢物種，而超過30年以后，鐵桿蒿會成為主要物種[18-20]。由于植被演替的原因進而可能會發(fā)生化感作用，影響根系分泌物的正常代謝，以致于發(fā)生自毒作用，試驗結果顯示在種植10年、20年苜蓿遠低于30年根系分泌物的數(shù)量和種類，這可能是因為苜蓿與長芒草共生條件下，由于化感作用導致了紫花苜蓿根系分泌物的種類和數(shù)量的相對減少。

評價土壤肥力的指標包括土壤養(yǎng)分因素、物理、化學以及生物因素。通過植物-土壤養(yǎng)分互作、微生物的作用可以促進植物根系的分泌，從而提高土壤養(yǎng)分有效性[21]。本研究著重以不同生長年限苜蓿為變量出發(fā)，通過GC-MS技術對苜蓿根系分泌物的化學組成以及相對含量進行分析，明確不同年限紫花苜蓿根系分泌物之間的差異性，從而探討隨著時間的推移苜蓿草地肥力變化特征并提供科學依據。

影響苜蓿的根系分泌物是多方面因素綜合作用的，對于本研究，影響較大的可能是植被演替，以及氣候因素。植被演替所產生的相關化感物質以及脅迫作用都會對根系分泌物的產生起到很大的影響。六道溝流域地處黃土高原蝕風蝕交錯帶的強烈侵蝕中心，相比室內土培條件，此地氣候因素更加復雜與多變。但本研究僅針對根系分泌物本身進行相關研究，但并未對相關幾個重要的影響因素進行相關性分析，包括根際土壤微生物以及根際土壤的理化性質并未涉及。

4 結論

苜蓿的根系分泌物主要含有烷烴類、酯類、醇類、酸類、酚類、酮類、醚類化合物，二氯甲烷和乙酸乙酯提取到的化合物中烷烴類化合物所占比重均在75%以上；二氯甲烷提取結果中，提取到的化合物種類數(shù)量為：30年>10年>20年>1年；乙酸乙酯提取結果中，提取到的化合物種類數(shù)量為：30年>10年>20年>1年；二氯甲烷和乙酸乙酯提取結果中均以二十一烷相對含量最大，且含量隨種植年限增長遞增。