菠蘿皮渣多糖的酶法制備及體外抗氧化活性研究

秦紫瓊，杭瑜瑜，裴志勝，齊 丹

（海南熱帶海洋學院生命科學與生態(tài)學院，海南三亞 572022）

0 引言

多糖是所有生命有機體的重要組成成分，并與維持生命所必需的多種功能有關，抵抗癌癥、增強免疫力、抵抗病毒感染、消炎、緩解高血糖和高血脂等方面都呈現(xiàn)出較好的效果[1-5]，在動植物中存在廣泛。

我國的菠蘿產(chǎn)量大，菠蘿罐頭是主要產(chǎn)品，在加工制作的過程中，菠蘿皮渣會作為廢物丟棄，造成資源浪費的同時污染環(huán)境[6]。然而，菠蘿皮渣中含有大量植物多糖，對其加以提取利用，能提高菠蘿的附加值。多糖的提取方法主要有溶劑浸提 法[7]、超聲波輔助提取法[8]等。采用此類方法提取時，大多以水作為溶劑，提取的多糖能力有限。在提取過程中加入合適的酶液，有助于降解細胞壁，從而使多糖能夠最大可能地溶解并釋放出來，提取率也會有所提高[9]。酶解法提取多糖的優(yōu)點也較多，如：提取條件比較溫和、產(chǎn)物中的雜質(zhì)容易除去，提取率較高[10]。采用木瓜蛋白酶法從菠蘿皮渣中提取多糖，并研究了其體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

菠蘿皮渣預處理工藝：新鮮的菠蘿皮渣→清洗→滅酶→干燥→粉碎過篩。

1.1.2 試劑

葡萄糖標準品，西亞試劑；無水乙醇、木瓜蛋白酶（酶活30×104U/g）、硫酸、苯酚、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸鐵、水楊酸、Tris-HCl、鄰苯三酚，以上均為分析純。

1.1.3 主要儀器

DX612C型干燥箱，雅馬拓科技貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；CS-700型高速多功能粉粹機，永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；Heraeus Multifuge X3型離心機，賽默飛世爾科技產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菠蘿皮渣多糖的提取工藝

稱取5.0 g菠蘿皮渣粉末置于錐形瓶中，加入適量蒸餾水，加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值，而后加入木瓜蛋白酶，在60℃條件下酶解2 h，在90℃條件下進行滅酶處理，靜置30 min后，過濾、濃縮，濃縮液用Savag法脫蛋白，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心15 min，上清液加入4倍體積的無水乙醇在4℃下沉淀24 h，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心20 min，收集沉淀，分別用丙酮、無水乙醚、無水乙醇洗滌，在60℃條件下真空干燥，所得產(chǎn)品即為菠蘿皮渣粗多糖。

1.2.2 多糖提取率的測定

1.2.3 單因素試驗和響應曲面優(yōu)化試驗

分別選取木瓜蛋白酶添加量、料液比、酶解pH值和酶解時間這4個因素進行單因素試驗，在此基礎上進行響應曲面試驗設計。

響應曲面試驗的因素水平見表1。

表1 響應曲面試驗的因素水平

1.2.4 菠蘿皮渣多糖體外抗氧化活性研究

參照李南薇等人[12]的方法，在比色管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，不同質(zhì)量濃度菠蘿粗多糖溶液 （50，75，100，125，150 mg/L） 2 mL， 加入5 mmol/L H2O2溶液3 mL，搖勻后靜置15 min，再加入5 mmol/L水楊酸溶液3 mL，搖勻后靜置40 min，于波長510 nm處測不同質(zhì)量濃度的菠蘿皮渣粗多糖吸光度A1。H2O2換為去離子水時測得的吸光度為A2，樣品換為去離子水時測得吸光度為A0。計算樣品對羥自由基的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 木瓜蛋白酶添加量的影響

在料液比1∶15，酶解pH值6.0，酶解溫度60℃的條件下酶解2 h，研究木瓜蛋白酶添加量對菠蘿皮渣多糖提取率的影響。

木瓜蛋白酶添加量對多糖提取率的影響見圖1。

由圖1可以看出，木瓜蛋白酶添加量在0.5%～1.5%時，多糖提取率增加迅速；當木瓜蛋白酶添加量大于1.5%時，多糖提取率呈下降的趨勢。木瓜蛋白酶添加量過低，會使酶解反應的速率降低且酶解不完全，從而使提取率降低；隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，反應速率加快，多糖提取率也逐漸增加，但木瓜蛋白酶添加量過多時，底物濃度過高會影響分子擴散性[13]，菠蘿皮渣多糖提取率有所下降。

2.1.2 料液比的影響

在木瓜蛋白酶添加量1.5%，酶解pH值6.0，酶解溫度60℃的條件下酶解2 h，研究料液比對菠蘿皮渣多糖提取率的影響。

料液比對多糖提取率的影響見圖2。

圖1 木瓜蛋白酶添加量對多糖提取率的影響

圖2 料液比對多糖提取效率的影響

由圖2可看出，增加提取液，多糖提取率會有所增高，因為提取液增加有利于提取的多糖轉(zhuǎn)移到液相中，提取率會升高。當料液比為1∶20時，多糖提取率達到最大，繼續(xù)增加溶液的用量，反應體系濃度過低，提取不完全，多糖提取率下降[14]。

2.1.3 pH值的影響

在木瓜蛋白酶添加量1.5%，料液比1∶15，酶解溫度60℃的條件下酶解2 h，研究酶解pH值對菠蘿皮渣多糖提取率的影響。

酶解pH值對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 酶解pH值對多糖提取率的影響

由圖3可看出，在酶解pH值4.0～6.0時，多糖提取率與酶解pH值呈正相關趨勢。當酶解pH值大于6.0時，多糖提取率有所下降。pH值酶活性和穩(wěn)定性影響較大，不適宜的酶解pH值會改變酶活性中心的構象，亦或是使整個酶分子的結(jié)構發(fā)生改變，從而導致其變性和失活，進而影響菠蘿皮渣多糖提取率[15]。

2.1.4 酶解時間的影響

在木瓜蛋白酶添加量1.5%，料液比1∶15，酶解pH值6.0，酶解溫度60℃條件下，研究酶解時間對菠蘿皮渣多糖提取率的影響。

酶解時間對多糖提取率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對多糖提取率的影響

表2 響應面法試驗結(jié)果

各因素交互作用對菠蘿皮渣多糖提取率影響的響應曲面見圖5。

圖5反映了各單因素和兩兩交互作用對多糖提取率的影響，結(jié)合表3和圖5的分析可以看出，各單因素對多糖提取率的影響程度為木瓜蛋白酶添加量＞酶解pH值＞料液比＞酶解時間，木瓜蛋白酶和料液比相互作用不顯著，酶解pH值和酶解時間相互作用不顯著，其余各因素的相互作用均顯著。

根據(jù)回歸方程模型分析可知，酶解法提取菠蘿皮渣多糖的最優(yōu)工藝為木瓜蛋白酶添加量1.29%，料液比1∶16（g∶mL），酶解pH值6.37，酶解時間3.24 h。

由圖4可知，在酶解時間3 h以內(nèi)，菠蘿皮渣多糖提取率與酶解時間呈正相關趨勢。當酶解時間超過3 h后，多糖的提取效率有所下降。在一定時間范圍內(nèi)，酶解時間越長，植物細胞壁及間層中的纖維素有所降解，一些大分子物質(zhì)（如糖類），會擴散到溶液中，多糖提取率有所提高。但超出一定時間范圍，酶解時間再延長，氫離子會水解一些多糖的主要成分，提取率有所下降。

2.2 響應曲面試驗結(jié)果與分析

采用軟件Design Expert 8.0.7中的Central Composite模式對料液比、木瓜蛋白酶添加量、酶解pH值、酶解時間設計響應面試驗。

響應面法試驗結(jié)果見表2，響應面試驗結(jié)果的方差分析見表3。

利用Design Expert 8.0.6軟件，木瓜蛋白酶添加量、料液比、酶解pH值、酶解時間進行多元擬合分析，得到二次多項回歸方程：

表3 響應面試驗結(jié)果的方差分析

2.3 菠蘿皮渣多糖的體外抗氧化活性測定結(jié)果

圖5 各因素交互作用對菠蘿皮渣多糖提取率影響的響應曲面

菠蘿皮渣多糖對羥基自由基的清除效果見圖6。

圖6 菠蘿皮渣多糖對羥基自由基的清除效果

由圖6可看出，隨著菠蘿多糖質(zhì)量濃度的逐漸增大，對羥自由基的清除能力越增強。對數(shù)據(jù)相關分析，得到多糖質(zhì)量濃度和清除率的回歸方程式為Y=0.244 7X-0.062，R2=0.996 2。

3 結(jié)論

通過單因素和響應曲面試驗，優(yōu)化了木瓜蛋白酶法提取皮渣中多糖的最佳提取工藝，木瓜蛋白酶添加量1.29%，料液比1∶16（g∶mL），酶解pH值6.37，酶解時間3.24 h，多糖提取率可達4.89%，所提多糖具有清除羥自由基的能力。