長期微重力暴露所致眼損傷疾病動物模型的構建*

李向前 任 澤 嚴偉明 龍 盤 陳 濤,3 張作明

(1. 空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院四大隊十九連，西安 710032)(2. 空軍軍醫(yī)大學航空航天臨床醫(yī)學教研室，西安 710032) (3.空軍軍醫(yī)大學衛(wèi)生勤務學教研室，西安 710032)

人類航天發(fā)展史已從短期航天飛行發(fā)展到中、長期航天飛行。而中、長期航天飛行所面臨的醫(yī)學問題更加復雜，對航天員也提出了更嚴峻的挑戰(zhàn)。良好的視覺功能是保證宇航員對航天器準確操控的基礎，是宇航員高質量完成各項飛行任務的重要保證。因此，微重力對眼部的影響成為國內外航天醫(yī)學工作者們關注的重要問題之一。但是，由于缺乏穩(wěn)定可靠的研究資源嚴重影響了該問題的研究。目前，參加過航天飛行任務的宇航員數量有限，其中具有長期航天飛行經歷的宇航員則少之又少。將動物直接置于外太空進行造模，成本過高且不便于實施。同時由于以往小動物眼部檢測技術的不足，導致目前尚無一種明確的地面模擬微重力導致眼部損傷疾病動物模型。但是，隨著各項中長期載人航天計劃的推進，當前急需在地面建立相應疾病動物模型。據此，本研究擬基于經典尾部懸吊模擬失重大鼠模型進行長期微重力暴露所致眼損傷疾病動物模型的探索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

正常SD大鼠,24只，(150～180)g/只，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證：[2014(陜)SCXK-002]。

1.2 方法

1.2.1實驗分組及處理：24只大鼠在實驗室內適應性飼養(yǎng)1周后，按隨機數表法分為兩個實驗組(M4組和M8組)和兩個對照組(N4組和N8組)，每組各6只。

M4組和M8組大鼠尾部懸吊按經典方法進行，單獨飼養(yǎng)于特制有機玻璃鼠籠內(如圖1)。具體方法包括尾部皮膚表面準備、粘貼固定和懸吊三個步驟。將要懸吊的大鼠置于自制大鼠限動盒中，使其尾部外露。先用肥皂水清洗尾部表面，并用電吹風吹干。再依次向尾部表面噴涂安息香酊和松香酊，并吹干，以防止粘貼物對皮膚的激惹作用。然后，自一側尾根部起，按縱向走行，將一長約20 cm，與尾部等寬的醫(yī)用膠布條，粘貼于尾部表面至距尾尖部3～5 cm處，再將膠布條繞過一空心小柱粘貼于對側的尾部皮膚上，另外兩側皮膚則不粘貼膠布以作為下次更換膠布時的粘貼部位。接著，在此段尾部的表面，再依次間斷地輕輕加繞2～3圈0.8 cm寬的膠布條和連續(xù)纏繞一層1.5 cm寬的紗布條，以對縱行膠布條進行加強固定。用一絞丁環(huán)將有縱行膠布條繞過的空心小柱與懸吊籠上可沿水平吊梁滑動的滑輪相連。絞丁環(huán)可使懸吊大鼠作360°的平面旋轉活動。調節(jié)水平吊梁高度，使大鼠的后爪在伸直時剛好不能觸及籠的底層，從而使動物始終保持呈頭低位(約-30°)。每7 d更換粘貼部位一次。對照組大鼠在同樣的環(huán)境中單籠飼養(yǎng)，尾部懸吊方法同實驗組，但并不呈-30°頭低位。各組大鼠均可自由進食飲水，動物房內溫度控制在(23±1)℃，并按照12 h光照與12 h黑暗交替的規(guī)律進行照明。在尾部懸吊4周或8周時對相應實驗組和對照組大鼠視覺功能和形態(tài)進行觀察評估，同時稱量實驗動物體質量及比目魚肌質量。

圖1 尾部懸吊SD大鼠示意圖Fig.1 The picture of a tail-suspended SD rat

1.2.2視覺電生理檢查：大鼠暗適應12 h，于紅光環(huán)境下進行視覺電生理檢查。操作方法簡述如下，大鼠常規(guī)麻醉后(3 mL/kg 1%戊巴比妥鈉+50 μL 100%速眠新)，托比卡胺散瞳后,將大鼠置于操作臺上固定，安放電極。視網膜電圖(ERG)電極位置：正極為角膜，負極為臉頰，接地為尾部皮下。視覺誘發(fā)電位(VEP)電極位置：正極為大腦枕葉對應皮下，負極為臉頰，接地為尾部皮下。隨后按照羅蘭電生理操作系統(tǒng)進行操作。

1.2.3小動物眼底照相和光相干斷層掃描(OCT)檢查：將固定并麻醉好的動物置于升降桌上，使用復方托品酰胺滴眼液常規(guī)散瞳，并用鹽酸奧布卡因進行表麻，擺好眼位，待瞳孔散大后將醫(yī)用透明質酸鈉涂于待測眼角膜上，與小動物眼底成像系統(tǒng)顯微鏡鏡頭接觸，調整實驗臺和鏡頭焦距并拍照；之后將眼科顯微成像系統(tǒng)光源調整聚焦，調整鏡頭焦點至視網膜，而后對視網膜進行光學相干斷層掃描(OCT)。每只實驗動物雙眼均進行拍照。實驗完成后用生理鹽水清洗雙眼，并用左氧氟沙星滴眼液滴眼預防感染。

1.2.4視網膜切片HE染色:活體實驗完成后麻醉處死實驗動物，取眼球，處理眼球周圍多余組織，將眼球固定于眼球固定液中固定2 h后，在角膜處用注射器扎一小孔，用眼科剪將角膜去除，撥出晶狀體，之后再將眼球放回固定液中繼續(xù)固定24 h。后續(xù)步驟同常規(guī)組織脫水、蠟塊包埋、切片制作及HE染色。

1.3 統(tǒng)計方法

ERG結果分析時選用暗適應3.0反應幅值及OPs反應幅值。VEP結果分析時選用P1波峰時值及幅值。OCT及HE染色結果分析視網膜外核層(ONL)厚度。所有數據采用(均值±標準差)進行描述，檢驗采用兩獨立樣本t檢驗，α=0.05。

2 結果

2.1 尾部懸吊對大鼠視覺功能影響

如圖2所示，尾部懸吊4周后，大鼠視覺功能(ERG和VEP)與對照組相比無統(tǒng)計學差異。而當尾部懸吊時間達到8周時，大鼠視覺功能出現(xiàn)明顯下降，ERG暗適應3.0反應[M8vs. N8：(686.60±86.20) vs. (158.80±23.69)μV,P<0.05]及震蕩電位OPs反應幅值[M8vs. N8：(52.36±25.31)vs. (18.64±3.25) μV,P<0.05]明顯下降，VEP反應幅值無明顯改變[M8vs. N8：(14.86 ±1.65) vs. (13.92±2.25) μV,P> 0.05]，但峰時值明顯延長[M8vs. N8：(89.83±4.98) vs. (96.67±4.41) ms,P<0.05](圖3)。

圖2 尾懸吊4周對大鼠視網膜功能和結構的影響注:A：ERG和VEP的典型波形；B： ERG暗適應3.0反應b波振幅統(tǒng)計結果；C：震蕩電位OPs反應振幅統(tǒng)計結果；D： VEP反應P1波振幅統(tǒng)計結果；E：VEP反應P1波峰時值統(tǒng)計結果；N.S.：無統(tǒng)計學意義Fig.2 The effects of 4-weeks tail suspension on rat retinal functionNote:A:The typical ERG and VEP waveform of M4 and N4 groups; B:Statistical results of the amplitude of b wave of dark-adapted3.0 ERG; C: Statistical results of the amplitude of dark-adapted 3.0 oscillatory potentials; D: Statistical results of the amplitudeof P1 wave of VEP; E: Statistical results of the latency of P1 wave of VEP; N.S.: No statistical significance

圖3 尾懸吊8周對大鼠視網膜功能和結構的影響注:A：ERG和VEP的典型波形；B： ERG暗適應3.0反應b波振幅統(tǒng)計結果；C：震蕩電位OPs反應振幅統(tǒng)計結果；D： VEP反應P1波振幅統(tǒng)計結果,N.S.：無統(tǒng)計學意義；E：VEP反應P1波峰時值統(tǒng)計結果；*P<0.05Fig.3 The effects of 8-weeks tail suspension on rat retinal functionNote:A:The typical ERG and VEP waveform of M8 and N8 groups; B:Statistical results of the amplitude of b wave of dark-adapted 3.0ERG; C: Statistical results of the amplitude of dark-adapted 3.0 oscillatory potentials; D: Statistical results of the amplitude of P1 wave of VEP, N.S.: No statistical significance; E: Statistical results of the latency of P1 wave of VEP; *P<0.05

2.2 尾部懸吊對大鼠視網膜結構影響

如圖4所示，尾部懸吊4周后，大鼠視網膜各層厚度與對照組相比無統(tǒng)計學差異。而當尾部懸吊時間達到8周時，OCT結果可看出大鼠視網膜外核層(ONL)較對照組大鼠明顯變薄，視網膜切片HE染色結果也證實了這一結果[(35.13±1.02) vs. (20.32±1.92) μm,P<0.05](圖5)，表現(xiàn)為視網膜退行性改變。

圖4 尾部懸吊4周對大鼠視網膜結構的影響注:N:對照組；M：模型組；ONL:外核層；INL：內核層；GCL:節(jié)細胞層；N.S.:無統(tǒng)計學意義Fig.4 The effects of 4-weeks tail suspension on rat retinal structureNote: A:The typical OCT results of M8 and N8 groups; B:The typical HE staining of retinal section of M8 and N8 groups;C: Statistical results of HE staining on the thickness of ONL; N.S.: No statistical significance

圖5 尾部懸吊8周對大鼠視網膜結構的影響注:N:對照組；M：模型組；ONL:外核層；INL：內核層；GCL:節(jié)細胞層；*P<0.05Fig.5 The effects of 8-weeks tail suspension on rat retinal structureNote:A:The typical OCT results of M8 and N8 groups; B:The typical HE staining of retinal section of M8 and N8 groups;C: Statistical results of HE staining on the thickness of ONL; *P<0.05

2.3 尾部懸吊對大鼠眼底血流影響

當尾部懸吊時間達到8周時，大鼠眼底雖未見明顯視乳頭水腫、棉絮斑等改變，但均可見脈絡膜血管血流增多現(xiàn)象(圖6)。

圖6 M8組與N8組大鼠典型眼底比較Fig.6 Comparison of typical fundus between M8 and N8 groups

2.4 尾部懸吊對大鼠體質量及比目魚肌質量影響

為了證實尾部懸吊8周的模擬失重效應，我們對大鼠體質量和比目魚肌質量進行稱量。結果顯示：尾部懸吊8周前后大鼠體質量與對照組間并無統(tǒng)計學差異，而模型組比目魚肌的質量較對照組明顯減輕(P<0.05)(圖7)。

圖7 尾部懸吊8周后大鼠體質量和比目魚肌質量比較注:A：尾部懸吊前大鼠體質量統(tǒng)計結果；B：尾部懸吊8周后大鼠體質量統(tǒng)計結果；C：尾部懸吊8周后大鼠比目魚肌質量統(tǒng)計結果。N.S.:無統(tǒng)計學意義；*P<0.05Fig.7 Comparison of the body weight and the soleus muscle weight between M8 and N8 groups.Note:A: Statistical results of body weight before tail suspension; B: Statistical results of body weight after tail suspension;C: Statistical results of soleus weight after tail suspension; N.S.: No statistical significance;*P<0.05

3 討論

由于短期航天飛行對眼部損傷并不明顯，因此早期人們對微重力引起的眼部病變的研究相對較少[1-2]。但是，隨著人們在太空中停留時間的延長，航天環(huán)境對眼部的損傷問題逐漸突顯。近年來，三大載人航天大國(美國、俄羅斯和中國)的研究都已經證實，長期航天飛行環(huán)境的暴露將引起航天員眼部損傷。特別是美國學者Mader等[1]對這一現(xiàn)象進行了詳細報道，對300名參加過航天飛行任務的航天員進行調查，發(fā)現(xiàn)飛行過程視力下降在短期飛行和長期飛行航天員中的發(fā)生率分別為29%和60%。同時，Mader等的研究中還對7名在太空飛行6個月的宇航員進行眼部檢查，結果顯示：7人平均眼壓升高，6人近視力減退，6人視網膜神經纖維層增厚，5人有視乳頭水腫，5人出現(xiàn)脈絡膜皺褶，5人眼軸變短，3人出現(xiàn)棉絮斑，2人視神經鞘膜擴張。但是，關于該損傷的具體機制還不完全清楚[2]，而合適的疾病動物模型是我們認識生命科學客觀規(guī)律的實驗方法和手段[3]。

已有多篇文獻[4-6]報道了失重對動物眼部結構和功能影響。這些研究均是將動物直接置于宇宙空間中飛行，使動物真正暴露于微重力等太空環(huán)境中，屬于最理想的狀態(tài)。但是，這種實驗的成本過高，且需要在空間站中配備從事動物實驗研究的專業(yè)人員。因此，在地面上建立一種良好的疾病動物模型是現(xiàn)階段研究長期微重力環(huán)境對眼部損傷急需解決的基礎問題。

雖然，該病發(fā)病機制尚不完全清楚，但是目前的絕大多數理論還是認為失重導致體液頭向轉移是其始動因素[2]。因此，本研究擬基于模擬失重經典動物模型(尾部懸吊后肢去負荷模型)開展相關工作。并從視網膜功能和形態(tài)上證實了尾部懸吊可較好地模擬長期微重力暴露所致眼部損傷效應。而且，摸索出最佳造模時間為尾部懸吊8周。在失重對心血管、骨骼等效應的研究中，尾懸吊時間多為4周。然而，我們的實驗結果表明，尾部懸吊4周并不能模擬出長期微重力暴露所致眼部損傷效應，直至尾部懸吊8周時方可較好地對該疾病進行模擬。