高能脈沖氙光致眼組織損傷防護(hù)方法研究*

龍 盤 嚴(yán)偉明 陳 濤 王 喆 張千里 薛軍輝 張作明

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天臨床醫(yī)學(xué)教研室，西安 710032)(2.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安 710032)

移動(dòng)式高能氙光消毒機(jī)利用惰性氣體氙氣產(chǎn)生強(qiáng)紫外脈沖，在極短的時(shí)間內(nèi)釋放出極高能量的原理，達(dá)到消毒和凈化空氣的效果。該設(shè)備由于具有殺菌效率高，時(shí)間短，冷滅菌等優(yōu)勢(shì)，目前已被應(yīng)用于動(dòng)物房傳遞窗消毒。但是高能脈沖光對(duì)動(dòng)物的視覺系統(tǒng)的安全性還不甚清楚，本實(shí)驗(yàn)主要通過系列視覺相關(guān)檢查對(duì)其安全性以及防護(hù)方法進(jìn)行評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1材料： 移動(dòng)式高能氙光消毒機(jī)(MX-3600)由西安富康空氣凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)。高能氙光消毒機(jī)外徑尺寸為515 mm×515 mm×880 mm(長(zhǎng)×寬×高)，脈沖氙燈(XENEX，美國)10 inch，波長(zhǎng)100～400 nm，頻率1～10 Hz。單次脈沖能量為207 J(約為紫外燈的50.000倍)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：60只SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.3大鼠固定裝置：塑料瓶20個(gè)，剪去底蓋，側(cè)壁剪開，塑料膠帶固定。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

隨機(jī)將SD大鼠(n=60)分為陽性對(duì)照組、手術(shù)鋪單組、薄白色塑料板組、薄棕色塑料板組、厚棕色塑料板組和陰性對(duì)照組(n=10)。將移動(dòng)式高能脈沖氙光消毒機(jī)設(shè)置工作參數(shù)頻率1 HZ，時(shí)間5 min，大鼠均固定于自制的大鼠固定器，放置高度80 cm，距離消毒機(jī)1 m處。重復(fù)上述操作，每日2次，連續(xù)暴露5 d后，觀察系列指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1裂隙燈觀察：SD大鼠于高能脈沖氙光照射5 d后，于結(jié)膜囊內(nèi)滴20 μL熒光素鈉(1%)，用2 mL生理鹽水緩慢沖洗。然后將SD大鼠置于裂隙燈鈷藍(lán)燈模式下拍攝，拍攝角度35°，調(diào)整焦距使得焦點(diǎn)落于角膜平面上。拍攝時(shí)按照角膜損傷評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分，將角膜分為四個(gè)象限，每個(gè)象限單獨(dú)積分，之后加起來。評(píng)分方法如下，0分：角膜無熒光素鈉著染，干凈透明；1分：角膜有點(diǎn)狀熒光素鈉著染，但是著染點(diǎn)小于30個(gè)；2分：角膜有點(diǎn)狀熒光素鈉著染大于30個(gè)，或者點(diǎn)狀損傷融合成片狀；3分：角膜有大片熒光素鈉著染。

1.3.2全視野閃光視網(wǎng)膜電圖(ffERG)：大鼠于末次高能脈沖光照射后暗適應(yīng)12 h，于紅光環(huán)境下進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖檢測(cè)。操作方法簡(jiǎn)述如下，大鼠常規(guī)腹腔注射麻醉后(3 mL/kg體質(zhì)量1%戊巴比妥鈉+50 μL 100%速眠新)，托比卡胺散瞳后，將大鼠置于操作臺(tái)上固定，正極為角膜銀電極，負(fù)極為臉頰針電極，尾巴針電極接地，按照羅蘭電生理操作系統(tǒng)進(jìn)行操作。操作標(biāo)準(zhǔn)為國際電生理標(biāo)準(zhǔn)的五項(xiàng)檢查。

1.3.3相干光斷層成像掃描(OCT)和眼底彩照檢測(cè)：大鼠常規(guī)麻醉后，托比卡胺散瞳后，將大鼠放置于特制的鼠臺(tái)，采用ISOCT眼科超顯微成像系統(tǒng)(optoprobe, Canada)對(duì)大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行斷層掃描。之后采用OPTO-III視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)(optoprobe, Canada)進(jìn)行眼底彩照的拍攝。

1.3.4病理檢測(cè)：小心摘取眼球之后，放置于制備的眼球固定液中，固定24 h后，脫水包埋制備蠟塊，于石蠟切片機(jī)切片(4 μm)，烤片脫水之后進(jìn)行角膜和視網(wǎng)膜HE病理染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察(DP71, Olympus, Japan)，每張切片觀察3個(gè)位置取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 裂隙燈(鈷藍(lán)光)觀察大鼠角膜熒光素鈉著染

熒光素鈉可以使上皮缺損的角膜著色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陰性對(duì)照組角膜干凈透明，無熒光素鈉著染，陽性對(duì)照組角膜有點(diǎn)狀、樹枝狀、片狀熒光素鈉著染；手術(shù)鋪單組角膜有點(diǎn)狀、片狀熒光素鈉著染；白色薄塑料板組角膜有點(diǎn)狀、樹枝狀熒光素鈉著染；棕色薄塑料板組和棕色厚塑料板組角膜干凈透明，未見明顯熒光素鈉著染，見圖1A。陽性對(duì)照組，手術(shù)鋪單組和白色薄塑料板組角膜熒光素鈉染色評(píng)分大于陰性對(duì)照組(P<0.05)；棕色薄玻璃板組和棕色厚玻璃板組角膜熒光素鈉染色評(píng)分和陰性對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1B。

圖1 角膜熒光素鈉染色及評(píng)分(n=10)注：A，角膜熒光素鈉染色；B，角膜熒光素鈉染色評(píng)分；a，陽性對(duì)照組；b，手術(shù)鋪單組；c，白色薄塑料板組；d，棕色薄塑料板組；e，棕色厚塑料板組；f，陰性對(duì)照組；點(diǎn)狀熒光素鈉著染(黑色箭頭)，樹枝狀熒光素鈉著染(黃色箭頭)，片狀熒光素鈉著染(紅色箭頭)；*P<0.05, a, b, c, d, evs fFig.1 Corneal fluorescein sodium staining and grading(n=10)Note:A, Corneal fluorescein sodium staining; B. The score of corneal fluorescein sodium staining; a, positive control group; b. surgical drapes group;c, thin white plastic sheet group; d, thin brown plastic sheet group; e, thick brown plastic sheet group; f, negative control group; The dot fluoresceinsodium (black arrow), the dendritic fluorescein sodium (yellow arrow), the fluorescein sodium dye (red arrow); *P<0.05, a, b, c, d, evs f

2.2 全視野閃光視網(wǎng)膜電圖(ffERG)

感光細(xì)胞對(duì)于強(qiáng)光損傷是非常敏感的， ffERG用來評(píng)估高能脈沖氙光對(duì)視網(wǎng)膜尤其是感光細(xì)胞的損傷。各組典型ffERG波形圖見圖2。

圖2 各組典型視網(wǎng)膜電圖表現(xiàn)注：A, 暗視3.0反應(yīng)；B，OPs波；C，明視3.0反應(yīng)a，陽性對(duì)照組；b，手術(shù)鋪單組；c，白色薄塑料板組；d棕色薄塑料板組；e棕色厚塑料板組；f，陰性對(duì)照組 Fig.2 Typical retinal electrogram of each groupNote：A, dark-adaptation 3.0 response; B, OPs wave; C, light-adaptation 3.0 response. a, positive control group; b. surgical drapes group; c, thin white plastic sheet group; d, thin brown plastic sheet group; e, thick brown plastic sheet group; f, negative control group

2.2.1暗視3.0反應(yīng)：陽性對(duì)照組和手術(shù)鋪單組暗視3.0反應(yīng)的b波振幅顯著小于陰性對(duì)照組(P<0.05)，陽性對(duì)照組和手術(shù)鋪單組暗視3.0反應(yīng)b波的峰時(shí)值延長(zhǎng)(P<0.05)；白色薄塑料板組，棕色薄塑料板組和棕色厚塑料板組暗視3.0反應(yīng)b波幅值和峰時(shí)值與陰性對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)，見圖3。

圖3 暗視3.0反應(yīng)b波幅值和峰時(shí)值(n=10)注：A，陽性對(duì)照組；B，手術(shù)鋪單組；C，白色薄塑料板組；D，棕色薄塑料板組；E，棕色厚塑料板組；F，陰性對(duì)照組*P<0.05, A, B, C, D, Evs F；**P<0.01, A, B, C, D, E vs FFig.3 The amplification b wave (dark-adaptation 3.0 response) and the peak time of b wave (n=10)A, positive control group; B. surgical drapes group; C, thin white plastic sheet group; D, thin brown plastic sheet group; E, thickbrown plastic sheet group; F, negative control group; *P<0.05, A, B, C, D, Evs F；**P<0.01, A, B, C, D, E vs F

2.2.2Ops波：陽性對(duì)照組和手術(shù)鋪單組∑OPs1-4與陰性對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)；白色薄塑料板組、棕色薄塑料板組和棕色厚塑料板組∑OPs1-4與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖4。

圖4 各組∑OPs1-4幅值(n=10)注：A，陽性對(duì)照組；B，手術(shù)鋪單組；C，白色薄塑料板組；D棕色薄塑料板組；E棕色厚塑料板組；F，陰性對(duì)照組*P<0.05, A, B, C, D, Evs FFig.4 The amplification of ∑OPs1-4 (n=10)Note：A, positive control group; B. surgical drapes group; C, thin whiteplastic sheet group; D, thin brown plastic sheet group; E, thick brownplastic sheet group; F, negative control group;*P<0.05, A, B, C, D, Evs F

2.2.3明視3.0反應(yīng):陽性對(duì)照組和手術(shù)鋪單組與陰性對(duì)照組相比明視3.0反應(yīng)b波振幅降低(P<0.05)，峰時(shí)值延長(zhǎng)(P<0.05)；白色薄塑料板組，棕色薄塑料板組和棕色厚塑料板組明視3.0反應(yīng)b波幅值和峰時(shí)值與陰性對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)，見圖5。

2.3 相干光斷層成像(OCT)

陽性對(duì)照組和各防護(hù)組的視網(wǎng)膜全層厚度與陰性對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而陽性對(duì)照組和手術(shù)鋪單組外核層厚度與陰性對(duì)照組相比變薄(P<0.05)，見圖6。

2.4 眼底彩照

眼底彩照結(jié)果顯示陽性對(duì)照組及各防護(hù)組眼底未見明顯異常，見圖7。

圖5 明視3.0反應(yīng)b波振幅和峰時(shí)值(n=10)注：A，陽性對(duì)照組；B，手術(shù)鋪單組；C，白色薄塑料板組；D棕色薄塑料板組；E棕色厚塑料板組；F，陰性對(duì)照組；*P<0.05, A, B, C, D, Evs FFig.5 The amplification b wave (light-adaptation 3.0 response) and the peak time of b wave (n=10)Note：A, positive control group; B. surgical drapes group; C, thin white plastic sheet group; D, thin brown plastic sheet group;E, thick brown plastic sheet group; F, negative control group; *P<0.05, A, B, C, D, Evs F

圖6 視網(wǎng)膜全層和外核層厚度注：a，陽性對(duì)照組；b，手術(shù)鋪單組；c，白色薄塑料板組；d，棕色薄塑料板組；e，棕色厚塑料板組；f，陰性對(duì)照組**P<0.01, a,b, c, d, e vs fFig.6 The thickness of whole retinal and outer nuclear layer (ONL)Note：a, positive control group; b. surgical drapes group; c, thin white plastic sheet group; d, thin brown plastic sheet group;e, thick brown plastic sheet group; f, negative control group; **P<0.01, a,b, c, d, e vs f

圖7 眼底彩照注：A：陽性對(duì)照組；B，手術(shù)鋪單組；C，白色薄塑料板組；D棕色薄塑料板組；E棕色厚塑料板組；F，陰性對(duì)照組Fig.7 Fundus photographNote：A, positive control group; B. surgical drapes group; C, thin white plastic sheet group; D, thin brown plastic sheet group; E, thick brown plastic sheet group; F, negative control group

2.5 病理改變

2.5.1角膜：角膜HE染色顯示陽性對(duì)照組可見角膜上皮層粗糙，基底層細(xì)胞增生活躍，基質(zhì)層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)斷裂皺褶，基質(zhì)交聯(lián)纖維變細(xì)；各防護(hù)組和陰性對(duì)照組角膜病理結(jié)構(gòu)未見明顯改變，見圖8。

2.5.2視網(wǎng)膜：視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果與OCT相一致，陽性對(duì)照組和手術(shù)鋪單組與陰性對(duì)照組相比視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞層數(shù)減少(P<0.05)，見圖9～10。

3 討論

SPF級(jí)動(dòng)物是各種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)使用動(dòng)物，而關(guān)于SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施建設(shè)的重要的一個(gè)環(huán)節(jié)就是消毒滅菌[1]。傳遞窗作為外界環(huán)境與動(dòng)物房潔凈室之間的傳遞通道，在防止病原微生物進(jìn)入潔凈環(huán)境起到重要作用。目前常用的傳遞窗消毒設(shè)備為紫外燈，由于其消毒時(shí)間長(zhǎng)以及消毒效率低，給實(shí)際應(yīng)用帶來諸多不便[2]。高能脈沖氙光由于其具有消毒效率高(殺菌率>99%)，消毒時(shí)間短(1 min)，冷消毒(不產(chǎn)生熱量)等一系列優(yōu)點(diǎn)[3-4]，其可能將取代傳統(tǒng)的物理和化學(xué)殺菌手段。但是，生物安全性等問題也隨著而來。

高能脈沖氙光瞬間釋放的超高能量，以及高能量電離空氣產(chǎn)生臭氧對(duì)動(dòng)物是否安全？尤其是動(dòng)物眼部組織成為困擾工作人員的一個(gè)問題。本研究發(fā)現(xiàn)，高能脈沖氙光最大照射時(shí)間5 min/次，2次/d，持續(xù)5 d后，會(huì)對(duì)動(dòng)物的角膜和視網(wǎng)膜產(chǎn)生一定程度的損傷，相關(guān)研究也表明強(qiáng)紫外線可造成視網(wǎng)膜功能的急性損傷，這種損傷往往恢復(fù)較快[5]，這種損傷類似于雪盲以及電弧性眼損傷等，往往1～2 d就會(huì)恢復(fù)[6]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)末次照射7 d后視網(wǎng)膜功能可以基本恢復(fù)正常(數(shù)據(jù)未給出)，為什么恢復(fù)時(shí)間晚于一般的強(qiáng)紫外線損傷呢？估計(jì)是否由于其產(chǎn)生紫外線的能量太強(qiáng)，白化大鼠缺乏視網(wǎng)膜色素上皮的保護(hù)，使得感光細(xì)胞由于局部能量過大產(chǎn)生凋亡[7]；亦或者是其產(chǎn)生的臭氧對(duì)視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能造成一定影響，這還有待于進(jìn)一步探索驗(yàn)證。

圖10 視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞層數(shù)量(n=5)注：A，陽性對(duì)照組；B，手術(shù)鋪單組；C，白色薄塑料板組；D棕色薄塑料板組；E棕色厚塑料板組；F，陰性對(duì)照組*P<0.05, A, B, C, D, Evs FFig.10 The number of retinal ONL cell layers (n=5)Note：A, positive control group; B. surgical drapes group; C, thin white plastic sheet group; D, thin brown plastic sheet group; E, thick brown plastic sheet group; F, negative control group;*P<0.05, A, B, C, D, Evs F

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)鋪單、白色薄塑料板、棕色薄塑料板和棕色厚塑料板對(duì)高能脈沖氙光眼部損傷均具有一定的防護(hù)作用，其中手術(shù)鋪單防護(hù)作用較弱。由于紫外線對(duì)眼睛的損傷主要與波長(zhǎng)，強(qiáng)度，照射時(shí)間，光照方式有關(guān)[8-9]。高能脈沖氙光主要產(chǎn)生短波長(zhǎng)的紫外線，短波長(zhǎng)的紫外線由于波長(zhǎng)短，能量大，衍射性差，對(duì)眼睛的損傷主要是角膜，但是由于其短時(shí)間釋放能量巨大，大約為到達(dá)地面太陽光強(qiáng)度的100 000倍，部分能量會(huì)通過光通路而作用于相應(yīng)的視網(wǎng)膜區(qū)域從而部分損傷視網(wǎng)膜。同樣的，對(duì)于高能脈沖氙光的防護(hù)也就相對(duì)比較容易，主要考慮兩個(gè)問題：1. 高能脈沖氙光的穿透力；2. 周圍墻壁的反射。針對(duì)于第一個(gè)問題，我們發(fā)現(xiàn)厚度為3 mm的白色塑料板就足以防護(hù)高能脈沖氙光的損傷，且深色的材料的防護(hù)效果要優(yōu)于淺色的材料。針對(duì)第二個(gè)問題，我們建議全面防護(hù)動(dòng)物的眼組織或者用疏松且容易吸收脈沖光的材料進(jìn)行墻壁布置。

綜上，高能脈沖氙光作為一種新型的動(dòng)物房消毒設(shè)備，具備一系列消毒優(yōu)點(diǎn)，但是其對(duì)動(dòng)物的眼睛的安全性具有一定影響，在使用過程中，操作人員需要做好動(dòng)物防護(hù)。