微生物氣溶膠與有害氣體聯(lián)合吸入動(dòng)態(tài)暴露動(dòng)物模型建立及評(píng)價(jià)*

唐 瑛 任小孟 陳雙紅 徐雄利 劉李娜 焦 勇

(海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)研究所，上海 200433)

大氣環(huán)境空氣污染對(duì)人群健康損害日益突出。呼吸系統(tǒng)是機(jī)體應(yīng)對(duì)異源性可吸入污染物的第一道防御屏障，免疫應(yīng)急和氧化應(yīng)激在呼吸系統(tǒng)清除異源性污染中發(fā)揮重要作用[1-3]。然而過(guò)度應(yīng)激又是導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)功能性及器質(zhì)性損傷的重要原因。呼吸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能損傷影響其防御能力，從而加重空氣污染物進(jìn)一步致機(jī)體多臟器甚至系統(tǒng)性損害。因此，呼吸系統(tǒng)對(duì)異源性污染刺激的應(yīng)激及響應(yīng)能力，對(duì)防御空氣污染致人群健康損害有重要意義。

甲醛(Formaldehyde, FA)是現(xiàn)代建筑中典型的代表性化學(xué)性污染物，廣泛地存在于塑料制品、樹脂和建筑材料中，也是家庭常用品如食品防腐劑、化妝品、消毒劑和殺菌劑的組分。此外，F(xiàn)A也是某些自然活動(dòng)(如火災(zāi))和人類活動(dòng)(如吸煙和汽車燃料燃燒)的副產(chǎn)物。FA作為人類致癌物，已被確定可引起鼻咽癌并可能引起白血病，F(xiàn)A暴露還可引起其它多種健康問(wèn)題如急慢性毒性、免疫毒性、造血毒性、生殖毒性、遺傳毒性等[2]。

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PAO)為廣泛存在于自然環(huán)境的條件致病菌，是導(dǎo)致急慢性呼吸系統(tǒng)感染的典型革蘭陰性桿菌。其細(xì)胞壁組成成分脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)，可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征、內(nèi)毒素休克、敗血癥、甚至多器官功能障礙綜合征，是制作急性肺損傷動(dòng)物模型有效成分[1]。

FA和PAO是現(xiàn)代建筑大氣環(huán)境典型空氣污染物，大氣環(huán)境中化學(xué)與生物污染物對(duì)呼吸系統(tǒng)的疊加損害逐漸被認(rèn)識(shí)，但系統(tǒng)性研究較少。因此，本文采用動(dòng)態(tài)吸入染毒系統(tǒng)，研究建立生化氣溶膠聯(lián)合暴露肺損傷動(dòng)物模型，并從組織結(jié)構(gòu)、應(yīng)激損傷因子和損傷效應(yīng)因子三個(gè)層面進(jìn)行模型有效性評(píng)價(jià)。該模型為進(jìn)一步開展大氣環(huán)境主要污染物長(zhǎng)期低劑量暴露對(duì)人群健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型建立

動(dòng)物暴露裝置為HOPE-MED 8050型動(dòng)態(tài)氣溶膠染毒暴露系統(tǒng)(天津合普工貿(mào)有限公司)。分析純FA溶液(國(guó)藥集團(tuán))，加入到標(biāo)準(zhǔn)配氣發(fā)生器，恒定溫度至(25±1)℃，F(xiàn)A自動(dòng)分析檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)暴露艙內(nèi)甲醛的動(dòng)態(tài)濃度，調(diào)節(jié)進(jìn)氣及載氣流量，維持艙內(nèi)穩(wěn)態(tài)濃度為(3.4±0.3) mg/m3。PAO1凍存甘油菌按常規(guī)條件復(fù)蘇、活化、傳代培養(yǎng)。以傳至3～6代細(xì)菌制備微生物氣溶膠發(fā)生懸液。預(yù)實(shí)驗(yàn)每隔10 min監(jiān)測(cè)暴露艙內(nèi)微生物濃度，確定試驗(yàn)時(shí)細(xì)菌懸液的初始濃度、氣溶膠發(fā)生器的進(jìn)液流量及動(dòng)態(tài)混合氣流量。最終控制暴露艙內(nèi)細(xì)菌的穩(wěn)態(tài)濃度至0.5～1×107cfu/m3。

8周齡雄性Wistar大鼠31只(中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體質(zhì)量(180±10 g)。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(7只): 普通室內(nèi)環(huán)境中飼養(yǎng)生長(zhǎng)28 d；FA吸入暴露組(8只)：艙內(nèi)(3.4±0.3) mg/m3穩(wěn)定暴露濃度，每天吸入2 h，連續(xù)吸入暴露28 d；PAO1氣溶膠吸入暴露組(8只)：PAO1氣溶膠穩(wěn)態(tài)濃度(0.5～1)×107cfu/m3，每天吸入2 h，連續(xù)吸入暴露28 d；FA與PAO1氣溶膠聯(lián)合吸入暴露組(8只)：每天FA(3.4±0.3) mg/m3暴露2 h，暴露結(jié)束后換新鮮空氣45 min, PAO1(0.5～1)×107cfu/m3暴露2 h, 連續(xù)暴露28 d。

1.2 動(dòng)物處理及取材

第28 天大鼠暴露吸入試驗(yàn)結(jié)束后2 h進(jìn)行麻醉。不同組別大鼠用5%水合氯醛 0.3 mL/ 100 g 腹腔注射麻醉。仰臥固定，開胸，暴露胸、腹腔。真空采血管抽取血樣本。并迅速分離完整的支氣管和肺，置于4%多聚甲醛充分混合固定，部分肺葉置液氮保存。固定組織按常規(guī)石蠟切片制作程序進(jìn)行包埋，切片,用HE染色、革蘭氏染色和Tunel原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.3 樣本檢測(cè)

1.3.1切片染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟，按《組織學(xué)與胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》操作[4]，進(jìn)行常規(guī)蘇木素/伊紅染色(國(guó)藥集團(tuán))，觀察肺組織的形態(tài)學(xué)變化。按《臨床微生物學(xué)手冊(cè)》操作[5]，進(jìn)行Gram 染色(上?？片敿紊锛夹g(shù)公司)，觀察各級(jí)支氣管及肺泡腔細(xì)菌殘留情況。Tunel DAB原位顯色法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡情況，操作參照試劑盒說(shuō)明(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.3.2血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè): 不抗凝自動(dòng)采血管采5 mL血樣，自然凝固15～20 min, 2 000 r/min離心10 min，收集血清樣本，4 ℃保存并送至解放軍411醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行IgM 含量和 SOD活性的定量檢測(cè)。用 ELISA 法測(cè)定血清細(xì)胞因子(IL-1β、IL-8、TNF-α、CC10)，用 bio-rad 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定光密度A值。大鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自上海信裕生物科技公司及南京建成生物工程研究所。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型肺形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)損傷比較

對(duì)大鼠肺臟大體特征觀察顯示：正常對(duì)照組大鼠肺臟濕潤(rùn)、粉紅色；AF實(shí)驗(yàn)組肺臟體積增大、顏色現(xiàn)蒼白；PAO實(shí)驗(yàn)組肺臟暗紫紅色淤血狀、組織彈性差；聯(lián)合暴露實(shí)驗(yàn)組肺臟灰白、有明顯實(shí)變特征。石蠟包埋切片HE染色后，每張切片在×400顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察。結(jié)果顯示：與對(duì)照組隨機(jī)視野相比，3組實(shí)驗(yàn)組肺組織都有不同程度間質(zhì)充血水腫、肺泡間隔增寬，肺組織出現(xiàn)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以聯(lián)合暴露組最明顯、PAO氣溶膠暴露組次之，AF暴露組較輕。聯(lián)合暴露組部分肺泡上皮細(xì)胞壞死脫落、內(nèi)皮層缺損，部分肺泡腔內(nèi)有粉紅色炎性滲出(圖1)。

圖1 大鼠肺及其組織石蠟切片 HE染色(×400)注：CO28:對(duì)照組；AF28:AF吸入暴露組；PAO28:PAO吸入暴露組；AF&PAO28聯(lián)合暴露組Fig.1 HE staining of rat lung paraffin embedding tissue HE(×400)Note: CO28: Control group; AF28: AF inhalation exposure group; PAO28:PAO1 inhalation exposure group;AF&PAO28: AF and PAO1 co-exposure group

圖2 大鼠支氣管、肺組織石蠟切片細(xì)胞凋亡Tunnel原位檢測(cè)(×400)注：CO28:對(duì)照組；AF28:AF吸入暴露28天實(shí)驗(yàn)組；PAO28:PAO1暴露28天實(shí)驗(yàn)組；AF&PAO28 AF和PAO1聯(lián)合暴露28天實(shí)驗(yàn)組Fig.2 In situ detection apoptosis of rat bronchial and lung paraffin sections tissues by Tunnel(×400)Note: CO28: Control group; AF28: AF inhalation exposure group; PAO28:PAO1 inhalation exposure group;AF&PAO28: AF and PAO1 co-exposure group

2.2 動(dòng)物模型肺、支氣管組織細(xì)胞損傷比較

肺及支氣管石蠟切片經(jīng)Tunnel原位染色，凋亡細(xì)胞核呈棕色，正常細(xì)胞核不顯色。每張切片在400倍顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示：對(duì)照組支氣管、肺組織細(xì)胞核空染、不著色；AF暴露組、PAO1氣溶膠暴露組，支氣管、肺組織切片不同視野中均見明顯胞核棕染的凋亡小體；與對(duì)照組及單因素暴露組比較，聯(lián)合暴露組支氣管、肺組織切片不同視野棕染凋亡小體數(shù)量顯著增多(圖2)。

2.3 動(dòng)物模型免疫應(yīng)急、氧化應(yīng)激指標(biāo)觀察

分別對(duì)大鼠血清免疫應(yīng)激指標(biāo)IgM水平、氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD活性檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，3實(shí)驗(yàn)組血清IgM均值升高，以AF&PAO28組增高最顯著，PAO28組次之，AF28組增加無(wú)顯著性意義。各實(shí)驗(yàn)組血清SOD活性增加明顯，與對(duì)照組比較都有顯著性差異(P<0.05),其中聯(lián)合暴露組較AF暴露組和PAO28暴露組升高更顯著(P<0.05)，見表1。

2.4 動(dòng)物模型免疫及氧化應(yīng)激損傷生物效應(yīng)指標(biāo)觀察

分別檢測(cè)大鼠肺應(yīng)激損傷代表性標(biāo)志物TNF-α、IL-1β(α亞型主要位于胞質(zhì))和IL-8、以及損傷修復(fù)代表性標(biāo)志物CC10，結(jié)果顯示：與其它3組比較，AF&PAO28組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平明顯升高(P<0.05)，CC10水平明顯降低(P<0.05)。AF28和PAO28組分別與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，見表2。

表1 不同暴露條件下大鼠血清IgM/SOD的檢測(cè)Table 1 Detection of serum IgM/SOD in rats under

注：CO28:對(duì)照組；AF28:AF吸入暴露28天實(shí)驗(yàn)組；PAO28:PAO1暴露28天實(shí)驗(yàn)組；AF&PAO28 AF和PAO1聯(lián)合暴露28天實(shí)驗(yàn)組

Note：＊AF&PAO28vs. PAO28 and AF28 and CO 28 (P<0.05)；﹟PAO28vs. AF28 / CO 28 (P<0.05)；※AF28vs. CO 28(P<0.05)

表2 吸入暴露后大鼠血清炎性效應(yīng)因子水平比較Table 2 Comparison of serum inflammatory factors in

注：CO28:對(duì)照組；AF28:AF吸入暴露28天實(shí)驗(yàn)組；PAO28:PAO1暴露28天實(shí)驗(yàn)組；AF&PAO28 AF和PAO1聯(lián)合暴露28天實(shí)驗(yàn)組

Note：aAF&PAO28vs. PAO28 /AF28 / CO 28 (P<0.05)；bPAO28vs. CO 28 (P<0.05)；cAF28vs. CO28 (P<0.05);

3 討論

化學(xué)有機(jī)物與微生物氣溶膠是大氣環(huán)境主要污染物，呼吸系統(tǒng)和心肺疾病的發(fā)病率、人群死亡率與長(zhǎng)期低劑量空氣污染物暴露正相關(guān)[6-9]。呼吸系統(tǒng)是空氣污染物進(jìn)入機(jī)體的第一道防御屏障，肺組織為清除異源性污染，炎性細(xì)胞被激活，釋放大量抗炎和促炎因子啟動(dòng)防御反應(yīng)。研究表明，肺組織在外來(lái)物質(zhì)的刺激下，肺泡巨噬細(xì)胞大量聚集產(chǎn)生活性氧，自由基產(chǎn)生后引起細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化及DNA損傷，造成細(xì)胞損傷，甚至凋亡[9]。因此，肺組織為清除異源性污染，炎性細(xì)胞被激活、釋放大量抗炎和促炎因子啟動(dòng)防御反應(yīng)。然而，過(guò)度的防御應(yīng)激即啟動(dòng)了炎癥過(guò)程、也促發(fā)了炎癥發(fā)展，造成肺部損傷。

本研究證實(shí)經(jīng)28 d 吸入暴露，AF暴露組和PAO1暴露組都能明顯誘導(dǎo)大鼠肺組織的炎性細(xì)胞聚集、肺組織呈現(xiàn)水腫等病理改變。聯(lián)合吸入暴露進(jìn)一步加劇大鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷效應(yīng)，伴有明顯的肺泡上皮細(xì)胞脫落等明顯結(jié)構(gòu)性損傷特征，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯。以上結(jié)果表明AF與PAO1聯(lián)合暴露，誘導(dǎo)了疊加損傷效應(yīng)。血清學(xué)指標(biāo)顯示，聯(lián)合暴露組大鼠血清IgM水平明顯升高、血清SOD活性明顯增強(qiáng)。IgM是機(jī)體遭受微生物感染后產(chǎn)生的免疫球蛋白、半衰期短，是機(jī)體近期遭受微生物感染的免疫應(yīng)激指標(biāo)，血清SOD活性則是指示機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的指標(biāo)。以往研究表明，甲醛可通過(guò)氧化應(yīng)激途徑誘發(fā)呼吸系統(tǒng)炎性損傷；而微生物分解物及其次級(jí)代謝產(chǎn)物，如：脂多糖、β1-3-葡聚糖等，既是強(qiáng)免疫應(yīng)激源也是強(qiáng)氧化應(yīng)激源。因此，本研究中聯(lián)合暴露組大鼠血清氧化應(yīng)激和免疫應(yīng)激指標(biāo)水平增加，進(jìn)一步指示甲醛與微生物氣溶膠聯(lián)合暴露產(chǎn)生的疊加損傷效應(yīng)導(dǎo)致大鼠機(jī)體處于高應(yīng)激損害狀態(tài)。

TNF-α、IL-1β(α亞型主要位于胞質(zhì))和IL-8是代表性促炎因子指示機(jī)體炎性損傷，CC10肺組織炎性損傷代表性修復(fù)標(biāo)志物[6-8]。TNF-α是肺泡巨噬細(xì)胞吞噬異物后釋放出的早期前炎性因子。TNF-α 被激活后不僅自身可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可進(jìn)一步刺激巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等釋放細(xì)胞因子及黏附分子，如 IL-1、IL-8等，這些黏附因子及細(xì)胞因子使中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、多形核白細(xì)胞等各種炎癥細(xì)胞聚集，產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子，形成級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，加重了肺組織的損傷。機(jī)體炎性損傷是一個(gè)整體反應(yīng),促炎和抗炎細(xì)胞因子之間動(dòng)態(tài)平衡就是機(jī)體損傷和修復(fù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。既往的研究表明，TNF-α、IL-1α、IL-1β和 IL-8 等促炎因子是肺損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是急性暴露肺損傷模型中的炎性反應(yīng)觀察的有效指標(biāo)。

綜上所述，甲醛及微生物氣溶膠聯(lián)合暴露促進(jìn)了肺部組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞損傷，導(dǎo)致肺組織細(xì)胞對(duì)異源污染物清除能力的減弱，從而增加了異源性污染對(duì)機(jī)體的侵害風(fēng)險(xiǎn)，誘使機(jī)體出現(xiàn)強(qiáng)防御應(yīng)激狀態(tài)，而過(guò)度的應(yīng)激狀態(tài)又可激活其他多途徑的生理效應(yīng)，加劇機(jī)體健康損害程度。這一研究結(jié)果提示，空氣環(huán)境中化學(xué)及生物有害因素復(fù)合暴露能增加機(jī)體的職業(yè)健康損害風(fēng)險(xiǎn)。因此，進(jìn)行環(huán)境主要有害因素職業(yè)性暴露損傷的早期健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)、并采取防御措施保護(hù)健康很有必要。