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    改良后的長春恒曉脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2活性檢測試劑性能驗證*

    2018-08-22 04:53:40王丹晨侯立安國秀芝秦緒珍高學(xué)慧夏良裕程歆琦
    關(guān)鍵詞:長春膽紅素制造商

    王丹晨,侯立安,國秀芝,秦緒珍,無 瓊,劉 茜,劉 荔,高學(xué)慧,夏良裕,程歆琦,邱 玲

    (1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科,北京 100730;2.內(nèi)蒙古赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科,內(nèi)蒙古赤峰 024000)

    脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoprotein associated phospholipase A2,Lp-PLA2)主要由動脈粥樣斑塊中的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,與脂蛋白相結(jié)合,產(chǎn)生溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸[1],產(chǎn)物具有促炎癥和促凋亡作用,可促進(jìn)動脈粥樣硬化形成[2]。Lp-PLA2在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及斑塊破裂中起關(guān)鍵作用,是心血管疾病的獨立危險因素[3~5]。目前市售的Lp-PLA2檢測試劑包括活性和質(zhì)量兩種,質(zhì)量檢測主要采用免疫學(xué)方法,標(biāo)本前處理時間長,不易于大樣本檢測。而活性測定可直接應(yīng)用于自動生化分析儀,操作簡便,耗時短,故有利于臨床推廣。我們既往對中國食品藥品監(jiān)督管理局注冊的4種Lp-PLA2活性試劑(上海德賽,長春恒曉,重慶中元,蘇州博源)進(jìn)行性能評價,發(fā)現(xiàn)長春恒曉Lp-PLA2活性試劑基本性能與制造商聲稱存在差異。為此,將結(jié)果反饋給制造商并進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn)后,再次進(jìn)行完整性能驗證。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象 收集2017年9~10月北京協(xié)和醫(yī)院患者臨床檢測剩余血清,制備不同Lp-PLA2活性的混合血清池。精密度驗證血清池的濃度約為550 U/L,40 U/L,每份血清池各分裝40份,-80℃凍存,試驗前室溫復(fù)融。分析選取濃度約為550U/L的Lp-PLA2活性混合血清池用于攜帶污染試驗;選取高、低水平的Lp-PLA2混合血清(約270 U/L,約180 U/L)用于干擾實驗;收集20例患者血清(分離膠真空采血管)及血漿(包括EDTA、肝素、枸櫞酸鈉抗凝3種)標(biāo)本,要求血清和血漿標(biāo)本必須是同時采集,用于不同標(biāo)本類型比對;收集110例患者臨床檢測剩余血清標(biāo)本用于方法學(xué)比對;留取40例表觀健康人(肝、腎功能均正常,除外溶血、脂血、黃疸)血清標(biāo)本,用于參考區(qū)間驗證;分析選取高、低水平的Lp-PLA2活性混合血清(約247 U/L,約152 U/L)用于試劑上機穩(wěn)定性驗證。本研究已經(jīng)通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查編號:S-K336)。

    1.2 試劑和儀器 試劑、質(zhì)控品、校準(zhǔn)品均由長春恒曉、上海德賽各制造商提供。所有測試均在Beckman AU5800全自動生化分析儀上進(jìn)行檢測。嚴(yán)格按照制造商提供的說明書在生化分析儀上設(shè)置參數(shù),按照標(biāo)準(zhǔn)化操作程序進(jìn)行校準(zhǔn)和質(zhì)控。

    1.3 方法

    1.3.1 精密度:參考 CLSI EP-15 A2[6]方案,同時用兩個不同批號的長春恒曉Lp-PLA2活性試劑檢測高、低水平的Lp-PLA2活性血清池,每天4次,連續(xù)5天測定。計算重復(fù)性和實驗室內(nèi)不精密度。

    1.3.2 線性:參考 CLSI EP6-A[7]方案,將低(L)、高(H)水平混合血清,按照體積比 L,0.9L︰0.1H,0.8L︰0.2H,0.7L︰0.3H,0.6L︰ 0.4H,0.5L︰ 0.5H,0.4L︰ 0.6H,0.3L︰ 0.7H,0.2L︰0.8H,0.1L︰0.9H,H,配制成11個梯度的混合血清。從低到高各檢測3次,記錄結(jié)果。

    1.3.3 攜帶污染:將高水平Lp-PLA2活性混合血清分裝30份,-80℃凍存,檢測前室溫復(fù)融。高值血清分別命名為H1,H2和H3,去離子水分別命名為 L1,L2 和 L3,以 H1,H2,H3,L1,L2,L3 的順序進(jìn)樣測量,連續(xù)測定5天。攜帶污染率絕對值<3%認(rèn)為符合標(biāo)準(zhǔn)。

    1.3.4 干擾:參考CLSI EP7-P[8]方案并進(jìn)行部分調(diào)整后,制備含有特定干擾物濃度(游離膽紅素、結(jié)合膽紅素、乳糜及血紅蛋白)的高、低水平Lp-PLA2活性干擾血清。低水平Lp-PLA2活性的干擾血清中游離膽紅素終濃度分別為5,10,20,40 mg/dl,結(jié)合膽紅素終濃度分別為 5,10,20,40 mg/dl,血紅蛋白終濃度分別為 2,4,6,8 g/L,乳糜的終濃度分別為125,250,500,1000 FTU。高水平 Lp-PLA2活性的干擾血清中游離膽紅素終濃度分別為9.6,19.1,28.65,38.2 mg/dl,結(jié)合膽紅素終濃度分別為 9.6,19.1,28.65,38.2 mg/dl,血紅蛋白終濃度分別為 2.55,5.1,7.65,10.2 g/L,乳糜的終濃度分別為 805,1610,2415,3220 FTU。分別測定混合血清各2次,求均值,計算添加干擾物和未添加干擾物血清測定值的預(yù)期偏差。以百分偏差超過±10%為標(biāo)準(zhǔn),判斷是否存在干擾。

    1.3.5 不同標(biāo)本類型比對:同時檢測20例患者的血清、血漿標(biāo)本,以制造商推薦的血清作為標(biāo)準(zhǔn),計算含有不同抗凝劑的血漿與血清標(biāo)本檢測Lp-PLA2活性預(yù)期偏差。

    1.3.6 與上海德賽Lp-PLA2活性試劑方法學(xué)比對:分別檢測110例比對用血清Lp-PLA2活性,參考CLSI EP9-A2[9]方案,以上海德賽測定結(jié)果作為X,長春恒曉測定結(jié)果作為Y,繪制散點圖,目測評價,顯示回歸方程Y=AX+B,計算截距(intercept)、斜率(slope)以及其95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)。

    1.3.7 參考范圍驗證:參考CLSI C28-A2[10]文件,檢測40例驗證血清Lp-PLA2活性,以第2.5分位和97.5分位數(shù)作為本實驗室初步評估建立的參考區(qū)間。為驗證表觀健康人Lp-PLA2酶活性與制造商聲稱的參考區(qū)間的一致性,統(tǒng)計分析了所有體檢對象檢測結(jié)果在制造商聲稱的參考區(qū)間內(nèi)所占的百分比,評估參考人群測定值中是否有超過90%(36例)的測定值落在制造商聲稱的參考區(qū)間內(nèi)。1.3.8 試劑上機穩(wěn)定性:制備高、低水平Lp-PLA2活性混合血清池,每天兩次,連續(xù)21天檢測Lp-PLA2活性,將第1天檢測結(jié)果作為Lp-PLA2活性水平的真實值,計算其他時間檢測結(jié)果與真實值的偏差,以差異≤5%作為標(biāo)準(zhǔn)評估試劑上機21天穩(wěn)定情況。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 Microsoft Excel 2016,SPSS 20.0以及Medcalc 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗。采用Passing Babloke和Bland Altman分析長春恒曉、上海德賽Lp-PLA2活性測定試劑的相關(guān)性及偏差。

    2 結(jié)果

    2.1 精密度評價 見表1。批號1重復(fù)性CV(%)和實驗室內(nèi)不精密度CV(%)分別為1.4%~4.4%,1.5%~5.1%;批號2重復(fù)性CV(%)和實驗室內(nèi)不精密度CV(%)分別為1.2%~3.1%,1.9%~4.8%。

    表1 精密度評價

    2.2 線性評價 見圖1。

    圖1 Lp-PLA2活性測定試劑線性評價

    長春恒曉Lp-PLA2活性測定試劑的線性范圍為40~550U/L,回歸決定系數(shù)R2為0.996,相關(guān)系數(shù)r為0.998,預(yù)期值和實測值的平均百分偏差均為2.82%。

    2.3 攜帶污染 該試劑攜帶污染為1.56%,小于3%,符合臨床檢測要求。

    2.4 干擾試驗 見表2。低水平Lp-PLA2活性混合血清在試驗濃度內(nèi)的四種干擾物(乳糜≤1000 FTU、游離膽紅素≤40 mg/dl,結(jié)合膽紅素≤40 mg/dl,血紅蛋白≤8 g/L)對該試劑無干擾;高水平Lp-PLA2活性混合血清在試驗濃度內(nèi)的三種干擾物(乳糜≤3220 FTU,游離膽紅素≤38.2 mg/dl,結(jié)合膽紅素≤38.2 mg/dl)對該試劑無干擾。但高Lp-PLA2活性混合血清在試驗濃度內(nèi)的血紅蛋白均對該試劑存在干擾。

    表2 干擾評價(百分偏差%)

    2.5 不同標(biāo)本類型比對 與血清相比,EDTA,枸櫞酸鈉、肝素抗凝的血漿標(biāo)本Lp-PLA2活性的百分偏差分別為-0.2%,-16.3%和-3.1%。

    2.6 與上海德賽方法學(xué)比對 見圖2。

    圖2 長春恒曉和上海德賽方法學(xué)比對結(jié)果

    回歸方程的截距(intercept)和斜率(slope)分別為-4.6(95%CI:-4.2~3.3)和 0.49(95%CI:0.48~0.49),決定系數(shù)R2為0.995,相關(guān)系數(shù)(r)為0.997(95%CI:0.996~0.998)。兩方法間差值(絕對偏倚)的平均值為-247.8 U/L,而所有差值分布的±1.96s為-549.2,53.6 U/L。兩方法間差值百分比的平均值為-71.2%,而所有差值百分比分布的±1.96s為-78.8%,-63.6%。兩方法間比值(相對偏倚)的平均值為0.48,而所有比值分布的±1.96s為 0.43,0.52。

    2.7 參考范圍驗證 本實驗室初步臨床評估建立的Lp-PLA2活性參考區(qū)間為68~374 U/L。40例標(biāo)本檢測結(jié)果中,共有20例(50%)Lp-PLA2活性檢測結(jié)果落在制造商聲稱的參考區(qū)間內(nèi)。

    2.8 試劑上機穩(wěn)定性 試劑開瓶放置于自動生化分析儀器內(nèi),連續(xù)21天檢測低、高混合血清的Lp-PLA2濃度,均與第1天檢測結(jié)果相比,平均百分偏差分別為4.5%,1.1%。

    3 討論本實驗室于2017年對長春恒曉Lp-PLA2活性試劑盒進(jìn)行性能驗證,發(fā)現(xiàn)該試劑活性存在以下兩個問題:①校準(zhǔn)品穩(wěn)定性較差,不同批號間校準(zhǔn)品、質(zhì)控品不可通用;②抗干擾(血紅蛋白、游離膽紅素、結(jié)合膽紅素、乳糜)能力較差[11]。故將結(jié)果反饋給制造商,制造商對Lp-PLA2活性測定試劑盒的參數(shù)盒試劑進(jìn)行了調(diào)整。具體修改的方案如下:①將原參數(shù) R1:75 μl,R2:15 μl,樣本量:15 μl調(diào)整為 R1:75 μl,R2:15 μl,樣本量:2 μl,提高試劑抗干擾能力,同時在保證精密度的前提下提高試劑的準(zhǔn)確性和線性范圍;②在校準(zhǔn)品中加入酶保護(hù)劑延長了校準(zhǔn)品的保存時間;③在R2試劑中加入穩(wěn)定劑,由于R2試劑溶劑為乙醇,試劑開瓶上機后,水分易揮發(fā),加入穩(wěn)定劑后,使得揮發(fā)減慢,提高試劑穩(wěn)定性。

    本研究結(jié)果顯示,改進(jìn)后的Lp-PLA2抗干擾能力有所提高,其性能參數(shù)與之前研究結(jié)果相符[11]。長春恒曉Lp-PLA2活性測定試劑改良后的基本性能較之前有所提高,能夠滿足臨床需求。本實驗室初步臨床評估建立的參考區(qū)間為68~374U/L,制造商標(biāo)注的參考范圍為≤220U/L,與初步評估結(jié)果相差較多,建議各實驗室根據(jù)就診人群建立符合各自實驗室的參考范圍。本研究進(jìn)一步證實了EDTA抗凝的血漿、肝素抗凝的血漿對于Lp-PLA2活性檢測無差異。開瓶的長春恒曉Lp-PLA2活性測定試劑可在自動生化分析儀上穩(wěn)定21天,可以保證檢測結(jié)果的可靠性。通過用戶反饋,改進(jìn)后的長春恒曉Lp-PLA2活性測定試劑的基本性能明顯提高。大量研究表明Lp-PLA2是一種新型的炎癥標(biāo)志物,在動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮重要的作用。李薪等[12]研究發(fā)現(xiàn),Lp-PLA2參與2型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程,定期監(jiān)測Lp-PLA2對于預(yù)防、治療和減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生有著重要的臨床意義。

    此外,劉玥等[13]研究發(fā)現(xiàn),腦微出血患者的Lp-PLA2水平明顯高于正常人群。因此,保證Lp-PLA2檢測結(jié)果的可靠性及準(zhǔn)確性,可以為臨床疾病預(yù)防、診斷、鑒別診斷及預(yù)后監(jiān)測提供有力的保障。

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