改良后的長春恒曉脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2活性檢測試劑性能驗證*

王丹晨，侯立安，國秀芝，秦緒珍，無 瓊，劉 茜，劉 荔，高學(xué)慧，夏良裕，程歆琦，邱 玲

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科，北京 100730;2.內(nèi)蒙古赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古赤峰 024000)

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoprotein associated phospholipase A2，Lp-PLA2)主要由動脈粥樣斑塊中的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，與脂蛋白相結(jié)合，產(chǎn)生溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸［1］，產(chǎn)物具有促炎癥和促凋亡作用，可促進(jìn)動脈粥樣硬化形成［2］。Lp-PLA2在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及斑塊破裂中起關(guān)鍵作用，是心血管疾病的獨立危險因素［3～5］。目前市售的Lp-PLA2檢測試劑包括活性和質(zhì)量兩種，質(zhì)量檢測主要采用免疫學(xué)方法，標(biāo)本前處理時間長，不易于大樣本檢測。而活性測定可直接應(yīng)用于自動生化分析儀，操作簡便，耗時短，故有利于臨床推廣。我們既往對中國食品藥品監(jiān)督管理局注冊的4種Lp-PLA2活性試劑(上海德賽，長春恒曉，重慶中元，蘇州博源)進(jìn)行性能評價，發(fā)現(xiàn)長春恒曉Lp-PLA2活性試劑基本性能與制造商聲稱存在差異。為此，將結(jié)果反饋給制造商并進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn)后，再次進(jìn)行完整性能驗證。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2017年9～10月北京協(xié)和醫(yī)院患者臨床檢測剩余血清，制備不同Lp-PLA2活性的混合血清池。精密度驗證血清池的濃度約為550 U/L，40 U/L，每份血清池各分裝40份，－80℃凍存，試驗前室溫復(fù)融。分析選取濃度約為550U/L的Lp-PLA2活性混合血清池用于攜帶污染試驗;選取高、低水平的Lp-PLA2混合血清(約270 U/L，約180 U/L)用于干擾實驗;收集20例患者血清(分離膠真空采血管)及血漿(包括EDTA、肝素、枸櫞酸鈉抗凝3種)標(biāo)本，要求血清和血漿標(biāo)本必須是同時采集，用于不同標(biāo)本類型比對;收集110例患者臨床檢測剩余血清標(biāo)本用于方法學(xué)比對;留取40例表觀健康人(肝、腎功能均正常，除外溶血、脂血、黃疸)血清標(biāo)本，用于參考區(qū)間驗證;分析選取高、低水平的Lp-PLA2活性混合血清(約247 U/L，約152 U/L)用于試劑上機穩(wěn)定性驗證。本研究已經(jīng)通過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查編號:S-K336)。

1.2 試劑和儀器 試劑、質(zhì)控品、校準(zhǔn)品均由長春恒曉、上海德賽各制造商提供。所有測試均在Beckman AU5800全自動生化分析儀上進(jìn)行檢測。嚴(yán)格按照制造商提供的說明書在生化分析儀上設(shè)置參數(shù)，按照標(biāo)準(zhǔn)化操作程序進(jìn)行校準(zhǔn)和質(zhì)控。

1.3 方法

1.3.1 精密度:參考 CLSI EP-15 A2［6］方案，同時用兩個不同批號的長春恒曉Lp-PLA2活性試劑檢測高、低水平的Lp-PLA2活性血清池，每天4次，連續(xù)5天測定。計算重復(fù)性和實驗室內(nèi)不精密度。

1.3.2 線性:參考 CLSI EP6-A［7］方案，將低(L)、高(H)水平混合血清，按照體積比 L，0.9L︰0.1H，0.8L︰0.2H，0.7L︰0.3H，0.6L︰ 0.4H，0.5L︰ 0.5H，0.4L︰ 0.6H，0.3L︰ 0.7H，0.2L︰0.8H，0.1L︰0.9H，H，配制成11個梯度的混合血清。從低到高各檢測3次，記錄結(jié)果。

1.3.3 攜帶污染:將高水平Lp-PLA2活性混合血清分裝30份，－80℃凍存，檢測前室溫復(fù)融。高值血清分別命名為H1，H2和H3，去離子水分別命名為 L1，L2 和 L3，以 H1，H2，H3，L1，L2，L3 的順序進(jìn)樣測量，連續(xù)測定5天。攜帶污染率絕對值＜3%認(rèn)為符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4 干擾:參考CLSI EP7-P［8］方案并進(jìn)行部分調(diào)整后，制備含有特定干擾物濃度(游離膽紅素、結(jié)合膽紅素、乳糜及血紅蛋白)的高、低水平Lp-PLA2活性干擾血清。低水平Lp-PLA2活性的干擾血清中游離膽紅素終濃度分別為5，10，20，40 mg/dl，結(jié)合膽紅素終濃度分別為 5，10，20，40 mg/dl，血紅蛋白終濃度分別為 2，4，6，8 g/L，乳糜的終濃度分別為125，250，500，1000 FTU。高水平 Lp-PLA2活性的干擾血清中游離膽紅素終濃度分別為9.6，19.1，28.65，38.2 mg/dl，結(jié)合膽紅素終濃度分別為 9.6，19.1，28.65，38.2 mg/dl，血紅蛋白終濃度分別為 2.55，5.1，7.65，10.2 g/L，乳糜的終濃度分別為 805，1610，2415，3220 FTU。分別測定混合血清各2次，求均值，計算添加干擾物和未添加干擾物血清測定值的預(yù)期偏差。以百分偏差超過±10%為標(biāo)準(zhǔn)，判斷是否存在干擾。

1.3.5 不同標(biāo)本類型比對:同時檢測20例患者的血清、血漿標(biāo)本，以制造商推薦的血清作為標(biāo)準(zhǔn)，計算含有不同抗凝劑的血漿與血清標(biāo)本檢測Lp-PLA2活性預(yù)期偏差。

1.3.6 與上海德賽Lp-PLA2活性試劑方法學(xué)比對:分別檢測110例比對用血清Lp-PLA2活性，參考CLSI EP9-A2［9］方案，以上海德賽測定結(jié)果作為X，長春恒曉測定結(jié)果作為Y，繪制散點圖，目測評價，顯示回歸方程Y=AX+B，計算截距(intercept)、斜率(slope)以及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)。

1.3.7 參考范圍驗證:參考CLSI C28-A2［10］文件，檢測40例驗證血清Lp-PLA2活性，以第2.5分位和97.5分位數(shù)作為本實驗室初步評估建立的參考區(qū)間。為驗證表觀健康人Lp-PLA2酶活性與制造商聲稱的參考區(qū)間的一致性，統(tǒng)計分析了所有體檢對象檢測結(jié)果在制造商聲稱的參考區(qū)間內(nèi)所占的百分比，評估參考人群測定值中是否有超過90%(36例)的測定值落在制造商聲稱的參考區(qū)間內(nèi)。1.3.8 試劑上機穩(wěn)定性:制備高、低水平Lp-PLA2活性混合血清池，每天兩次，連續(xù)21天檢測Lp-PLA2活性，將第1天檢測結(jié)果作為Lp-PLA2活性水平的真實值，計算其他時間檢測結(jié)果與真實值的偏差，以差異≤5%作為標(biāo)準(zhǔn)評估試劑上機21天穩(wěn)定情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 Microsoft Excel 2016，SPSS 20.0以及Medcalc 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗。采用Passing Babloke和Bland Altman分析長春恒曉、上海德賽Lp-PLA2活性測定試劑的相關(guān)性及偏差。

2 結(jié)果

2.1 精密度評價 見表1。批號1重復(fù)性CV(%)和實驗室內(nèi)不精密度CV(%)分別為1.4%～4.4%，1.5%～5.1%;批號2重復(fù)性CV(%)和實驗室內(nèi)不精密度CV(%)分別為1.2%～3.1%，1.9%～4.8%。

表1 精密度評價

2.2 線性評價 見圖1。

圖1 Lp-PLA2活性測定試劑線性評價

長春恒曉Lp-PLA2活性測定試劑的線性范圍為40～550U/L，回歸決定系數(shù)R2為0.996，相關(guān)系數(shù)r為0.998，預(yù)期值和實測值的平均百分偏差均為2.82%。

2.3 攜帶污染 該試劑攜帶污染為1.56%，小于3%，符合臨床檢測要求。

2.4 干擾試驗 見表2。低水平Lp-PLA2活性混合血清在試驗濃度內(nèi)的四種干擾物(乳糜≤1000 FTU、游離膽紅素≤40 mg/dl，結(jié)合膽紅素≤40 mg/dl，血紅蛋白≤8 g/L)對該試劑無干擾;高水平Lp-PLA2活性混合血清在試驗濃度內(nèi)的三種干擾物(乳糜≤3220 FTU，游離膽紅素≤38.2 mg/dl，結(jié)合膽紅素≤38.2 mg/dl)對該試劑無干擾。但高Lp-PLA2活性混合血清在試驗濃度內(nèi)的血紅蛋白均對該試劑存在干擾。

表2 干擾評價(百分偏差%)

2.5 不同標(biāo)本類型比對 與血清相比，EDTA，枸櫞酸鈉、肝素抗凝的血漿標(biāo)本Lp-PLA2活性的百分偏差分別為－0.2%，－16.3%和－3.1%。

2.6 與上海德賽方法學(xué)比對 見圖2。

圖2 長春恒曉和上海德賽方法學(xué)比對結(jié)果

回歸方程的截距(intercept)和斜率(slope)分別為－4.6(95%CI:－4.2～3.3)和 0.49(95%CI:0.48～0.49)，決定系數(shù)R2為0.995，相關(guān)系數(shù)(r)為0.997(95%CI:0.996～0.998)。兩方法間差值(絕對偏倚)的平均值為－247.8 U/L，而所有差值分布的±1.96s為－549.2，53.6 U/L。兩方法間差值百分比的平均值為－71.2%，而所有差值百分比分布的±1.96s為－78.8%，－63.6%。兩方法間比值(相對偏倚)的平均值為0.48，而所有比值分布的±1.96s為 0.43，0.52。

2.7 參考范圍驗證 本實驗室初步臨床評估建立的Lp-PLA2活性參考區(qū)間為68～374 U/L。40例標(biāo)本檢測結(jié)果中，共有20例(50%)Lp-PLA2活性檢測結(jié)果落在制造商聲稱的參考區(qū)間內(nèi)。

2.8 試劑上機穩(wěn)定性 試劑開瓶放置于自動生化分析儀器內(nèi)，連續(xù)21天檢測低、高混合血清的Lp-PLA2濃度，均與第1天檢測結(jié)果相比，平均百分偏差分別為4.5%，1.1%。

3 討論本實驗室于2017年對長春恒曉Lp-PLA2活性試劑盒進(jìn)行性能驗證，發(fā)現(xiàn)該試劑活性存在以下兩個問題:①校準(zhǔn)品穩(wěn)定性較差，不同批號間校準(zhǔn)品、質(zhì)控品不可通用;②抗干擾(血紅蛋白、游離膽紅素、結(jié)合膽紅素、乳糜)能力較差［11］。故將結(jié)果反饋給制造商，制造商對Lp-PLA2活性測定試劑盒的參數(shù)盒試劑進(jìn)行了調(diào)整。具體修改的方案如下:①將原參數(shù) R1:75 μl，R2:15 μl，樣本量:15 μl調(diào)整為 R1:75 μl，R2:15 μl，樣本量:2 μl，提高試劑抗干擾能力，同時在保證精密度的前提下提高試劑的準(zhǔn)確性和線性范圍;②在校準(zhǔn)品中加入酶保護(hù)劑延長了校準(zhǔn)品的保存時間;③在R2試劑中加入穩(wěn)定劑，由于R2試劑溶劑為乙醇，試劑開瓶上機后，水分易揮發(fā)，加入穩(wěn)定劑后，使得揮發(fā)減慢，提高試劑穩(wěn)定性。

本研究結(jié)果顯示，改進(jìn)后的Lp-PLA2抗干擾能力有所提高，其性能參數(shù)與之前研究結(jié)果相符［11］。長春恒曉Lp-PLA2活性測定試劑改良后的基本性能較之前有所提高，能夠滿足臨床需求。本實驗室初步臨床評估建立的參考區(qū)間為68～374U/L，制造商標(biāo)注的參考范圍為≤220U/L，與初步評估結(jié)果相差較多，建議各實驗室根據(jù)就診人群建立符合各自實驗室的參考范圍。本研究進(jìn)一步證實了EDTA抗凝的血漿、肝素抗凝的血漿對于Lp-PLA2活性檢測無差異。開瓶的長春恒曉Lp-PLA2活性測定試劑可在自動生化分析儀上穩(wěn)定21天，可以保證檢測結(jié)果的可靠性。通過用戶反饋，改進(jìn)后的長春恒曉Lp-PLA2活性測定試劑的基本性能明顯提高。大量研究表明Lp-PLA2是一種新型的炎癥標(biāo)志物，在動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮重要的作用。李薪等［12］研究發(fā)現(xiàn)，Lp-PLA2參與2型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程，定期監(jiān)測Lp-PLA2對于預(yù)防、治療和減少糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生有著重要的臨床意義。

此外，劉玥等［13］研究發(fā)現(xiàn)，腦微出血患者的Lp-PLA2水平明顯高于正常人群。因此，保證Lp-PLA2檢測結(jié)果的可靠性及準(zhǔn)確性，可以為臨床疾病預(yù)防、診斷、鑒別診斷及預(yù)后監(jiān)測提供有力的保障。