糖尿病腎病動物模型研究進展*

牛苗苗 陳 華

(解放軍總醫(yī)院，北京 100853)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus, DM) 全身性微血管病變中較常見的一種并發(fā)癥，其病理特征包括腎小球基底膜彌漫性增厚，系膜基質增生擴張，并可出現(xiàn)腎小球硬化，腎小管萎縮，腎間質纖維化，進而出現(xiàn)腎功能異常，最終形成終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)。在歐美等發(fā)達國家，DN已經(jīng)成為終末期腎衰竭的主要原因，也是糖尿病致死的主要原因。近年來DN在我國的發(fā)病率亦迅速上升，目前已成為終末期腎病的第二位病因。糖尿病腎病的防治已迫在眉睫，但其發(fā)病機制尚未闡明。建立理想的動物模型對闡明其發(fā)病機理、更新防治策略具有重要意義。

目前使用的DN動物模型多基于糖尿病模型建立的基礎，主要包括誘發(fā)性、自發(fā)性和基因修飾糖尿病腎病模型，但尚未發(fā)現(xiàn)有任何的模型可以復制所有的人類DN結構和功能的變化。美國糖尿病并發(fā)癥動物模型協(xié)會(Animal Models of Diabetic Complications Consortium，AMDCC) 對DN動物模型提出了以下三個標準：(1)動物整個生存期腎小球濾過率(glomerular filtration rate, GFR)下降大于50%；(2)與同品系同性別同年齡的對照組相比，尿蛋白增加10倍以上；(3)組織病理學檢查異常，包括系膜多發(fā)性硬化癥(系膜體積增加50%)，任何程度的小動脈玻璃樣變性，腎小球基底膜(GBM)增厚(電鏡下與基線相比增加25%以上)，以及腎小管間質纖維化[1]。然而目前尚未建立同時滿足以上三個標準的理想DN動物模型。本文對目前比較常用的DN動物模型及其特點進行綜述(見表1)。

1 誘發(fā)性DN動物模型

1.1 誘發(fā)性1型DN模型

1型糖尿病是由于胰島素的絕對缺乏導致機體產生高血糖。造模時常采用手術或化學藥物損傷動物的胰腺或胰島β細胞導致胰島素缺乏，引起實驗性高血糖，以此模擬1型糖尿病。長期持續(xù)性的高血糖則可引發(fā)DN等并發(fā)癥，然而手術切除胰腺后的動物多在未出現(xiàn)并發(fā)癥時就死于糖尿病本身，因此誘發(fā)性1型DN動物模型多采用鏈脲佐菌素(STZ)、四氧嘧啶(ALX)等藥物損傷胰島β細胞進行造模[2]，模型動物主要采用大鼠和小鼠。

1.1.1高劑量STZ誘導的DN模型：小鼠單次腹腔注射高劑量STZ(≥200 mg/kg體質量)，可以增加胰島β細胞毒性，導致糖尿病發(fā)生率增高和嚴重程度加劇，一般幾個月即可檢測到中等程度蛋白尿和腎小球硬化。該模型易操作，成模率高，但也存在一定的弊端。首先，高劑量STZ會引發(fā)嚴重的高血糖，需要密切監(jiān)測血糖濃度，必要時給予適量胰島素，避免動物死亡。其次，高劑量STZ對腎臟和肝臟組織也具有一定的毒性，可造成小鼠急性肝、腎損傷[3]，因此很難辨別該模型腎組織的病變是由于高劑量STZ所致還是高血糖的結果。為了減輕STZ造成的肝腎損傷，人們也采用低劑量STZ多次注射誘導糖尿病。

表1 糖尿病腎病常用嚙齒類模型及其特征Table 1 Rodent models and their characteristics of diabetic nephropathy

注：GFR，腎小球濾過率；NR，未見報道；-，陰性；+，輕度；++，中度；+++，重度。

Note：GFR, glomerular filtration rate; NR, not reported; -, negative; +, mild; ++, moderate; +++, severe.

1.1.2低劑量STZ誘導的DN模型：低劑量STZ多次注射可導致胰島β細胞低程度地反復損傷，也可成功誘導糖尿病。STZ誘導的大鼠糖尿病腎病是最經(jīng)典的DN模型，其優(yōu)點在于簡單經(jīng)濟，大鼠的病理生理學特征與人類較為接近，且便于重復采血監(jiān)測腎臟生理，并能獲得足夠的腎組織進行后續(xù)分析[4]。一般選取SD(Sprague-Dawley)、WKY(Wistar-Kyoto)、SHR(spontaneously hypertensive)等品系的8周齡大鼠，空腹16 h后腹腔注射STZ 40～60 mg/kg，連續(xù)注射3 d。注射后1周，測定空腹血糖15 mmol/L以上者納入DN研究[5]。也有學者對一側腎臟進行全部或部分切除術，可縮短實驗周期、減少STZ的劑量[6]。腎臟病理改變包括腎小球系膜細胞增生、系膜擴張，腎小球基底膜增厚等[3]。

另外也可選用小鼠進行造模， AMDCC建議每天腹腔注射STZ 50 mg/kg，連續(xù)注射5 d。然而不同品系小鼠對STZ的敏感性和非特異性毒性也存在一定的差異，常用小鼠品系對STZ的易感性依次為DBA/2>C57BL/6 J>MRL/MP>129/SvEv>BALB/c，且雄性小鼠較雌性小鼠更敏感[3, 7]，造模時應根據(jù)實際情況調整劑量。

1.1.3其他：實驗用犬、豬等一些大型哺乳動物也用于DN建模[8]。實驗用犬在四氧嘧啶誘導兩年后觀察到腎小球病變，對一側腎臟進行全部或部分切除術，可縮短實驗周期。同樣，實驗用豬也用于研究早期腎小球病變和評價藥物治療效果[9]。本實驗室應用120 mg/kg STZ一次性腹腔注射成功誘導五指山小型豬糖尿病模型，15個月檢測到尿蛋白陽性，28個月腎臟組織病理觀察到腎小球系膜擴張、硬化和腎小管上皮變性。這些大動物模型，在生理結構和代謝機制上更接近于人，且能獲得足夠的血液、尿液標本和腎臟組織進行檢測，應用活檢和內窺鏡技術還可以監(jiān)測腎臟組織的時序性改變。然而，現(xiàn)有的大動物DN模型也僅能模擬人類早期腎臟病變，并未觀察到腎小管間質纖維化和/或腎功能下降等進展期腎病病變，且造模時間長、成本高，限制了大動物DN模型的應用。另外，果蠅、斑馬魚等模式動物也存在原始腎原細胞[10]，可用于研究基因功能和早期藥物篩選[8]。

1.2 誘發(fā)性2型DN模型

2型糖尿病是以胰島素抵抗為主伴有不同程度的胰島素分泌不足的代謝性疾病。最初研究者采用高能量飲食(高糖、高脂或高糖高脂飲食)誘導來建立2型糖尿病的疾病模型，然而往往大多僅觀察到高胰島素血癥、肥胖等表現(xiàn)，很難獲得高血糖或糖尿病的動物。之后一些學者發(fā)現(xiàn)高能量飲食結合小劑量的STZ誘導可以更成功地獲得2型糖尿病動物模型[11-12]。并且該模型可以很好地模擬人類2型糖尿病的代謝特征和進展過程，長期的糖尿病微血管病變導致動物產生腎臟病變。

目前成功誘導2型DN模型的實驗動物主要有大鼠、小鼠和小型豬，其中SD大鼠是最為常用的模式動物。誘導飼料配方多采用蔗糖37%、牛油或豬油10%、基礎飼料53%。基礎飼料配方為玉米48%、小麥次粉20%、大豆餅15%、稻米糠12%、魚粉5%。常規(guī)造模方法先采用高能量飲食喂養(yǎng)2周，啟動胰島素抵抗的誘發(fā)；空腹6～8 h后30～35 mg/kg STZ腹腔注射，3～7 d后即可監(jiān)測到血糖升高；繼續(xù)高能量飲食喂養(yǎng)至8周或12周時再次腹腔注射30～35 mg/kg STZ。一般飲食喂養(yǎng)14周后可觀察到早期腎臟病變，IV型膠原、結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)、轉化生長因子β(transforming growth factor β, TGFβ)等人類糖尿病腎病病變過程中的重要因子也顯著升高[13]。也有學者先將8周齡SD大鼠注射40 mg/kg STZ，9 d后行右側腎臟切除術，術后兩周開始高脂飲食(蛋白質13.5%，脂肪11.3%，纖維素2.2%，碳水化合物5.1%，無氮浸出物59.4%，水8.5%)誘導，15周后模型組動物血糖顯著升高，出現(xiàn)明顯的微量白蛋白尿，肌酐清除率逐漸下降，25周出現(xiàn)腎小球系膜擴張、彌漫性硬化[14]。還有學者將成年雄性Wistar大鼠單側腎切除后3周，飼喂高脂飼料5周，然后比較單純注射STZ(40 mg/kg)與聯(lián)合注射煙酰胺(230 mg/kg)和STZ(65 mg/kg)的效果。結果顯示，第30周時兩組均表現(xiàn)出DN的早期特征，但聯(lián)合注射組腎臟組織形態(tài)學和功能變化更明顯，且具有較高的重復性和穩(wěn)定性?？傊?，動物的遺傳背景、飲食配方(特別是脂肪的含量)、化學藥物的種類和劑量以及禁食的時間都可以影響模型的成功率，實驗時可根據(jù)具體情況適當調整[15]。

2 自發(fā)性DN動物模型

自發(fā)性DN動物模型是指未經(jīng)任何人工處理自然發(fā)生的，或由于基因突變、染色體異常，通過定向培育保留下來的糖尿病動物模型，進而發(fā)生糖尿病腎病病變。這類動物模型更接近自然的人類疾病，但來源有限，繁殖飼養(yǎng)條件要求高，發(fā)病率低，造模周期長，價格昂貴，因此多用于糖尿病及其并發(fā)癥機制及藥效學研究。目前已用于研究的自發(fā)性DN動物約有20 種，按照糖尿病對應的分類可分為自發(fā)性1型DN模型和自發(fā)性2型DN模型兩類。

2.1 自發(fā)性1型DN模型

2.1.1NOD小鼠：NOD小鼠是由日本學者Makino等人(1980 s)利用ICR小鼠選育得到的非肥胖糖尿病近交品系，是目前應用最廣泛的自發(fā)性1型糖尿病動物模型。該模型的特點包括：(1)臨床癥狀上與人類1型糖尿病相似，表現(xiàn)為高血糖、尿糖、多尿、多飲；(2)含有多基因易感位點：包括特定的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)II類基因和許多非MHC位點；(3)胰島內炎性細胞浸潤(胰腺炎)，伴胰島細胞自身抗體；(4)對T細胞嚴重依賴。由于自身免疫因素，NOD小鼠一般在4周至5周齡時胰腺自發(fā)出現(xiàn)程度不等的炎癥，24周至30周齡時胰島β細胞被大量破壞而發(fā)生顯性糖尿病，雌鼠的發(fā)病率比雄鼠高4倍。出現(xiàn)高血糖后，尿蛋白排泄量可增加7倍[1]。腎臟病理逐漸出現(xiàn)系膜細胞增生，腎小球毛細血管基底膜增厚，細胞外基質增多，最后出現(xiàn)腎小球硬化[16]。該模型很好地驗證了人類DN發(fā)病過程中，TGF-β1及晚期糖基化終產物(advanced glycosylation end products, AGE)在系膜增生和腎小球硬化中發(fā)揮了重要作用[1]。

2.1.2BB大鼠：BB大鼠來源于Wistar 大鼠，是加拿大Bio Breeding Laboratories于1974年育成可自發(fā)1型糖尿病的突變種群。BB大鼠在12周左右出現(xiàn)體質量降低、多尿、煩渴、高血糖癥和胰島素缺乏。腎臟組織病理學改變一般比較輕微，18個月時才出現(xiàn)系膜擴張，腎小球基底膜增厚，通常無明顯蛋白尿[17]。

2.2 自發(fā)性2型DN模型

自發(fā)性2型DN模型特點為胰島素抵抗性高血糖癥，病程長，不合并酮癥。常用的有ob/ob小鼠、db/db小鼠、KK小鼠、GK大鼠、OLETF 大鼠、ZDF大鼠等。

2.2.1ob/ob小鼠：ob/ob小鼠是由于6號染色體上的ob基因突變，造成其編碼的瘦素蛋白缺乏，引起肝糖原異生顯著增加產生高血糖，進而刺激胰島素異常分泌，最終發(fā)生胰島素抵抗而形成的糖尿病模型。ob突變?yōu)槌Ｈ旧w隱性遺傳，純合子可表現(xiàn)為高血糖、高胰島素血癥以及肥胖，其嚴重程度主要取決于小鼠的遺傳背景，一般腎臟病變較輕[1]。

2.2.2db/db小鼠：db/db小鼠是由于4號染色體上的db基因突變，造成其編碼的瘦素受體蛋白轉錄異常所致的先天肥胖性2型糖尿病模型。db/db小鼠發(fā)生糖尿病的病程與人類極為相似，且易產生微血管并發(fā)癥，特別是糖尿病腎病，是目前建立2 型DN模型應用最廣泛的動物[18]。db基因突變最初在C57BLKS/J 品系中誘導，后來引入到C57BL/6 J 品系中。小鼠在出生后10 d即表現(xiàn)出高胰島素血癥，8周齡出現(xiàn)嚴重高血糖、蛋白尿，12至14周出現(xiàn)明顯的組織形態(tài)學改變，表現(xiàn)為腎小球肥大，系膜區(qū)增寬，基底膜增厚，腎功能明顯受損，但至25 周齡時其蛋白尿并無明顯變化[19]。db/db小鼠的臨床表現(xiàn)與遺傳背景相關，C57BLKS/J遺傳背景的db/db突變小鼠會發(fā)展為暴發(fā)型糖尿病，24周齡后需要外源胰島素維持生存，而C57BL/6 J背景的小鼠發(fā)病相對溫和[20]。但兩者都不會發(fā)展到腎小球硬化和進行性腎功能不全的階段，通常用于研究人類早期DN病變。

2.2.3KK小鼠：KK小鼠是1957年由K.Kondo用Kasukabe小鼠培育而成，表現(xiàn)為胰島素抵抗和肥胖，雄性小鼠較雌性更為嚴重，在10到15周齡時可出現(xiàn)蛋白尿。1969年Nishimura等將KK小鼠2號染色體上的黃色肥胖基因(Ay基因)突變得到KKAy小鼠，使其更易發(fā)生高血糖和蛋白尿，腎臟病理改變也更為嚴重，包括彌漫性、中重度系膜基質擴張，系膜細胞增生，局灶性腎小球硬化，足細胞丟失等，但不發(fā)生腎間質纖維化[21]。

2.2.4GK(Goto Kakizaki)大鼠：GK大鼠是1975年由Goto等人從遠交系Wistar大鼠選育而來，其特征為中度高血糖，外周胰島素抵抗，非肥胖，血脂正常。腎臟病變主要為人類DN早期可見的形態(tài)學變化，如腎小球肥大、基底膜增厚等，至8月齡時仍不會出現(xiàn)明顯的蛋白尿，但孔麗麗等報道24月齡時可見節(jié)段性腎小球硬化、腎小管間質纖維化等中晚期DN表現(xiàn)，蛋白尿也顯著增加[22]。

2.2.5OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty)大鼠：OLETF大鼠是利用Long-Evans 系大鼠建立的自發(fā)性2 型糖尿病動物模型，是研究DN最好的嚙齒類動物模型之一[23-24]。OLETF 大鼠膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK) -2A 受體信使RNA表達完全缺失，導致消化道對CCK 刺激無反應，引起食欲亢進、肥胖，早期以胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂為主，以后逐漸出現(xiàn)胰腺功能減退，胰島纖維化，至23 周齡可觀察到腎小球系膜基質部分擴張，30 周齡起尿蛋白迅速增加，36周齡時蛋白尿可高達200 mg/24h[25]，逐漸出現(xiàn)腎臟系膜基質增生、腎小球基底膜增厚、小動脈透明樣變等，至65周齡可見腎小球結節(jié)樣變、基底膜膨脹，腎小管間質受損[21]，這都與臨床2 型DN 患者的病理表現(xiàn)極為相似，是研究DN及其防治措施的良好模型。

2.2.6ZDF(Zucker diabetic fatty)大鼠：ZDF大鼠即Zucker糖尿病肥胖大鼠，是由于瘦素受體基因突變導致多食、肥胖同時伴有高胰島素血癥、高血糖、外周胰島素抵抗、脂代謝異常、中度高血壓和蛋白尿等，但無酮癥表現(xiàn)[26]。臨床表現(xiàn)雌雄差別較大，雌性ZDF大鼠需要糖尿病飲食誘導才能出現(xiàn)高血糖[27]。雄性ZDF大鼠一般3至8周齡自發(fā)出現(xiàn)胰島素抵抗和糖耐量受損癥狀，8至10周齡發(fā)生嚴重的糖尿病[28]。6周齡時，尿蛋白已高于對照，之后逐漸增多。12周齡時可見輕度腎肥大，至16周齡腎肥大已很明顯，據(jù)報道14%的ZDF 大鼠會出現(xiàn)中度腎積水，至36周齡時60%表現(xiàn)為中度、30%為重度腎積水[29-30]。病理形態(tài)上，ZDF大鼠可產生典型的局灶性腎小球硬化和腎小管間質纖維化等病變[31]，與人類非胰島素依賴型DN非常相似，但不會發(fā)生腎小球結節(jié)性硬化和彌漫性系膜溶解等進展期腎病病變。

3 基因修飾動物DN模型

基因修飾動物是指應用基因工程技術將動物基因組特定位點的遺傳物質引入新遺傳信息、對基因進行敲除、替換等最終獲得某種或某些新的遺傳性狀，并且這種基因修飾可以遺傳給后代?；蛐揎梽游顳N模型，可以幫助我們研究糖尿病相關基因的功能、致病機制，而且提供了更加豐富的模型，彌補了經(jīng)典的誘發(fā)性和自發(fā)性DN模型無法重現(xiàn)重度或中晚期人類DN腎臟病變的不足[32]。

3.1 eNOS敲除小鼠

eNOS 是一氧化氮(nitric oxide, NO)合成的限速酶，其功能的異?；蛉笔筃O調節(jié)脈管系統(tǒng)通透性的功能減弱，引起血管內皮細胞損傷。而內皮損傷是糖尿病及DN血管病變的重要機制和病理特征[33]。將C57BLKs/J背景的db/db小鼠進行eNOS基因敲除獲得eNOS-/-db/db小鼠，在較短的時間內即出現(xiàn)蛋白尿，其尿蛋白可增加30倍以上，后期逐漸出現(xiàn)許多類似于人類晚期DN的病理改變，包括廣泛的系膜基質擴張，系膜溶解，基底膜增厚，小動脈玻璃樣變性，腎小管間質纖維化等[34]。此外，eNOS-/-db/db小鼠在26周齡時，腎小球濾過率甚至可以下降50%，是目前能夠模擬人類DN 晚期功能及形態(tài)學結構改變的最好的小鼠模型。eNOS基因缺失還可加重STZ誘導的糖尿病動物的腎臟病變的嚴重程度[35]。遺傳背景來看C57BL/6小鼠對腎臟病變相對不敏感，然而引進eNOS基因敲除后，腎小球系膜擴張和局灶性硬化均顯著增加，蛋白尿可增長10倍[36]。目前eNOS基因敲除可在C57BL/6，db/db小鼠(C57BLKs/J)和BALB/cBy品系中實現(xiàn)[3]。

3.2 BTBRob/ob小鼠

BTBR(black and tan, brachyuric)小鼠自發(fā)胰島素抵抗，Clee和Attie將ob/ob突變引入到BTBR 小鼠品系中獲得BTBRob/ob小鼠，早期即可獲得持續(xù)性高血糖[37]。BTBRob/ob小鼠在第4周時開始出現(xiàn)進行性蛋白尿，8周后可見腎小球肥大、腎小球系膜基質擴張，20周內即出現(xiàn)類似于人類DN晚期的腎臟病變，包括嚴重的系膜擴張(50%以上)，腎小球基底膜增厚，系膜溶解，彌漫性腎小球硬化(局部接近結節(jié)性硬化癥表現(xiàn))，小動脈玻璃樣變性，持續(xù)性足細胞丟失，腎小管間質纖維化等。該模型的突出優(yōu)點即在很短的時間內迅速建立類似人類DN晚期的形態(tài)學和功能改變，是檢測臨床DN晚期治療干預措施的良好模型。研究發(fā)現(xiàn)，外源性重組瘦素治療8周可改善BTBRob/ob小鼠高血糖、蛋白尿和腎小球硬化，研究者推測這種功能的恢復可能與腎單位的平均足細胞數(shù)目增加相關[38]。

3.3 轉基因OVE26小鼠

轉基因OVE26小鼠是將胰島素2 增強子調控的鈣調素基因轉入到小鼠體內，使鈣調素蛋白在胰島β細胞中高表達導致胰島素分泌障礙而產生的1型糖尿病動物模型[39]。雄性OVE26小鼠與雌性野生型FVB小鼠交配得到的雜合小鼠，2月齡即可出現(xiàn)嚴重的蛋白尿，并隨年齡增長持續(xù)惡化，至9月齡時平均尿白蛋白排泄量已超過15 mg/24 h，同時腎小球濾過率也顯著下降。腎臟病理形態(tài)改變包括明顯的腎小球肥大，腎小球基底膜增厚，足細胞丟失，膜基質擴張伴彌漫性、結節(jié)性的腎小球硬化，腎小管間質纖維化等許多類似于人類DN晚期的病變[40]。此外該模型還很好地反映了氧化應激和炎癥在DN進展過程中的病理作用[41]。

3.4 Akita Ins2+/C96Y小鼠

AkitaIns2+/C96Y小鼠是由胰島素2基因C96Y單一突變造成胰島素蛋白的異常折疊產生胰腺β細胞毒性，最終導致胰島素分泌障礙形成高血糖的1型糖尿病動物模型，是模擬早中期DN腎臟病變的良好模型[35]。突變的雜合子通常在3至4周齡時由于嚴重的胰島素缺乏而發(fā)生高血糖，一般雄性小鼠比雌性小鼠更缺乏胰島素，而純合子通常在圍生期即死亡。伴隨持續(xù)性的高血糖，小鼠表現(xiàn)出不同程度的蛋白尿和輕至中度的腎小球系膜擴張，足細胞缺失[18, 42]，其病變程度與遺傳背景相關。Ins2+/C96Y突變可發(fā)生在C57BL/6、 DBA/2和129/SvEv遺傳背景的小鼠，三種品系的小鼠高血糖程度相當，但DBA/2-Ins2+/C96Y表現(xiàn)為更嚴重的蛋白尿，而C57BL/6和129/SvEv在6月齡時出現(xiàn)中等程度的系膜擴張，而DBA/2-Ins2+/C96Y未見系膜損傷[21]。此外，Haseyama等報道C57BL/6背景的Akita小鼠20周齡時開始出現(xiàn)不明原因的彌漫性免疫球蛋白A 系膜沉積，因此不能應用該品系小鼠評價糖尿病血管病變對系膜增生的影響[43]。

4 結語

經(jīng)典DN模型主要表現(xiàn)出腎小球肥大、基質擴張等早期腎臟病變的特征，而基因修飾DN模型可以模擬腎小球硬化癥、小動脈玻璃樣變性、腎小管間質纖維化等中重度糖尿病腎病病變，且有許多與人類DN相似的基因改變，為我們提供了一些新的研究思路。雖然當前的DN模型并不能完整地反映人類DN的發(fā)病過程和機制，但通過明確研究目標，合理地選擇與人類DN病變相對應的糖尿病類型、分期、病理變化的DN動物模型，進行機制研究和干預措施的臨床前試驗可以幫助我們不斷更新對DN的認識。研究過程中，我們不僅要關注腎臟功能和組織形態(tài)的改變，還要探索基因、轉錄、蛋白水平的變化，評估這些變化與人類疾病的相關性，并建立相應的生物樣本和數(shù)據(jù)庫。通過這些研究信息可以幫助我們更加有效合理地建立和選擇最合適的動物模型，豐富我們的研究成果，并逐步轉化為臨床實踐[8]。同時，也要加強新型DN 動物模型的開發(fā)，建立病因、病程及病理生理改變等都與人類相似的DN 動物模型，為DN機制研究及防治提供更好的研究工具。