胰腺癌患者臨床特征與異種移植模型的相關(guān)性*

張 賀 張彩勤 趙 勇 譚鄧旭 師長宏

(1.原沈陽軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)務部，沈陽 110015)(2.第四軍醫(yī)大學實驗動物中心，西安 710032)

胰腺癌(Pancreatic cancer)是一種惡性程度很高的消化系統(tǒng)腫瘤。臨床患者治療效果十分有限，5年生存率低至6%，約20%的患者有手術(shù)機會，術(shù)后5年生存率僅為25%[1]。利用免疫缺陷小鼠建立胰腺癌異種移植(patient-derived xenograft，PDX)模型[2]，能夠很好地保持腫瘤的遺傳特性和異質(zhì)性，使人們更進一步了解了胰腺癌的生物學特點，而且能夠針對不同患者開發(fā)個體化治療方案[3]。然而，胰腺癌PDX影響因素、成模規(guī)律及生長特性等機制問題尚不清楚[4]。影響PDX成模的關(guān)鍵因素可能是認知胰腺癌的新視角。本研究通過分析62例胰腺癌患者的臨床癥狀和腫瘤的病理學特征，探索與PDX成模率的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及福利倫理審查

6～7周齡SPF級雄性裸鼠，體質(zhì)量22～25 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司 [SCXK(蘇)2016-0010] 提供。飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心SPF級屏障設施 [SYXK(陜)2014-001]。環(huán)境溫度23～25 ℃，相對濕度40%，12 h晝夜交替，飼料經(jīng)輻照處理，飲用水經(jīng)高壓滅菌處理，動物自由攝食和飲水。本研究動物實驗通過了第四軍醫(yī)大學實驗動物福利及倫理委員會批準，編號：14013。

1.2 患者信息及腫瘤病理特征

62例胰腺癌患者來自第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院(2015年4月至2016年4月)，確診為胰腺癌，并接受了根治性意向手術(shù)?；颊咝畔⒓澳[瘤標本的取得經(jīng)過患者本人及家屬同意，并簽署知情同意書，建立患者信息、腫瘤特征及移植瘤模型三者相對應的數(shù)據(jù)庫，供分析研究。人體標本實驗通過西京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，批準編號：2015432。

1.3 試劑及藥物

基質(zhì)膠由美國BD公司生產(chǎn)，DMSO購自Sigma公司，胎牛血清由浙江天杭生物科技股份有限公司生產(chǎn)，蘇木精和伊紅染色液購自北京雷根(Leagene)生物技術(shù)有限公司，組織基因組DNA提取試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)。

1.4 胰腺癌PDX模型的建立及傳代

將患者新鮮的腫瘤組織剪為3 mm3碎塊，混合適量的基質(zhì)膠，利用穿刺針移植到裸鼠背部皮下，命名為P1代；移植瘤生長至1 000 mm3時，異氟烷麻醉小鼠，手術(shù)獲取腫瘤組織，在另一只裸鼠皮下進行傳代，命名為P2代，以此類推，傳代至P5代。記錄代際間隔時間(從皮下接瘤到移植瘤收獲的時間)；凍存各代腫瘤組織(凍存液成分為：10%DMSO+90%胎牛血清)，復蘇后觀察生長速率。取P5代瘤組織，利用試劑盒提取基因組DNA，送西京醫(yī)院司法鑒定中心進行STR基因分型檢測。

1.5 組織形態(tài)學觀察

取原發(fā)瘤及各代移植瘤組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.6 腫瘤組織CA19-9抗原檢測

將制備的組織切片經(jīng)脫蠟后，弱酸性環(huán)境中微波修復抗原，封閉非特異性蛋白并消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，一抗CA19-9(1∶100)孵育過夜；加入二抗(羊抗鼠)，DAB顯色后蘇木精復染，酒精脫水、甲醛透明并封片；光學顯微鏡下觀察。

1.7 血清CA19-9的檢測

各代PDX模型心臟采血，5 000 r/min離心10 min，分離上層血清，送西京醫(yī)院檢驗科檢測CA19-9含量。

1.8 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 患者群體臨床特征、腫瘤病理特征與PDX模型的相關(guān)性

根據(jù)腫瘤植入狀態(tài)評估了實驗室接受到的62例患者樣本，建立PDX模型，總成模率為47%，見表1和表2。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)患者人口統(tǒng)計學或臨床特征與PDX成模率之間相關(guān)性不顯著，P>0.05；分析發(fā)現(xiàn)，是否接受輔助治療與PDX成模率相關(guān)性不顯著，P=0.258；腫瘤轉(zhuǎn)移情況、術(shù)后復發(fā)情況(術(shù)后復發(fā)統(tǒng)計數(shù)量為去除轉(zhuǎn)移患者數(shù)量)和手術(shù)類型(根據(jù)切除胰腺部位分為Whipple、middle、distal和total 4類)與成模率相關(guān)性不顯著，P>0.05?；颊吣[瘤的病理特征分析表明，腫瘤細胞的分化程度和生長位置與PDX成模率之間相關(guān)性不顯著，P=0.846、P=0.057；胰腺原發(fā)瘤的大小與PDX成模率之間存在顯著相關(guān)性，P=0.041；腫瘤細胞浸潤淋巴系統(tǒng)情況與PDX成模率之間相關(guān)性極顯著，P=0.001。相比之下，腫瘤細胞浸潤神經(jīng)系統(tǒng)并未表明存在顯著的相關(guān)性，P=0.681。

表1 基于62例胰腺癌患者臨床特征和PDX模型相關(guān)性統(tǒng)計Table 1 the correlation of clinical features and PDXmodels based on 62 pancreatic cancer patients

注：Whipple：胰十二指腸切除術(shù)(pancreatoduodenectomy, PD)；middle：中段胰腺切除(middle segment pancreatectomy)；distal：胰體尾切除術(shù)(distal pancreatectomy, DP)；total：全胰切除術(shù)(total pancreatectomy, TP)

Note： Whipple：pancreatoduodenectomy; middle：middle segment pancreatectomy; distal：distal pancreatectomy; total：total pancreatectomy

注：組間比較差異性顯著，*P<0.05，組間差異性極顯著，**P<0.01

Note： comparison among groups significant difference，*P<0.05， comparison among groups extremely significant difference，**P<0.01

2.2 原發(fā)瘤與P1至P5代PDX模型移植瘤的一致性

2.2.1STR基因分型檢測：STR(short tandemrepeat)基因分型檢測所選取的16個位點具有種屬特異性，是從人類的23對染色體中所挑選的等位基因，多態(tài)性程度高。分析所選取的基因是由2～6個堿基構(gòu)成一個核心序列，核心序列串聯(lián)重復排列，序列和重復次數(shù)決定多態(tài)性。在所選取的16個人類基因位點均檢測到信號，其人源性判定率為99.99%。

2.2.2腫瘤分化特征對比：HE染色后，對比原發(fā)瘤、P1至P5代PDX模型腫瘤分化特征(圖1 A)，不同分化程度的原發(fā)瘤經(jīng)過5次傳代后，仍然能夠保持不同的分化程度。

2.2.3胰腺癌特異性抗原CA19-9免疫組化分析：原發(fā)瘤組織和P1代至P5代PDX模型移植瘤組織中胰腺癌特異性抗原CA19-9表達呈陽性，見圖1B；兩者CA19-9抗原表達無差異。

2.2.4血清中CA19-9的檢測結(jié)果：血清CA19-9含量是胰腺癌臨床診斷的重要指標，臨床檢測參考值為27 U/mL。患者血清CA19-9值與各代PDX模型血清CA19-9值均高于參考值，提示發(fā)生胰腺癌，見圖2。

圖1 患者與各代PDX模型分化特征(圖A)和特異性抗體CA19-9對比(圖B)(×20， scale bar=20 μm)Fig.1 Comparison of the differentiation and the specific antibody CA19-9 between patient’stumor (Fig.A) and PDX models (Fig.B)(×20， scale bar=20 μm)

圖2 患者與各代PDX模型的血清CA19-9對比Fig.2 Comparison of serum CA19-9 betweenpatients’ and PDX models

3 討論

人類癌癥的復雜性和異質(zhì)性是建立臨床前動物模型不可避免的兩個難題。PDX模型能夠較好地保持親本腫瘤中大多數(shù)的關(guān)鍵基因和信號通路活性[5-6]，能夠更好地模擬患者基因?qū)W特征和病理學特征[7]。在胰腺癌研究中，臨床前和臨床研究的共同障礙是難以獲得足夠量的腫瘤組織，這一定程度上阻礙了深入研究胰腺癌的致病機理、生長規(guī)律及分子特征。Mattie等[8]建立胰腺癌PDX模型，經(jīng)過多次傳代后，原發(fā)瘤的基因表達模式在PDX模型中得以維持，同時61%的患者原發(fā)瘤樣本建立了對應的PDX模型，成功預測了患者不良預后。Jun等[9]利用SCID(severe combined immune deficiency)鼠建立胰腺癌PDX模型，成模率為55.8%。本研究胰腺癌樣本量為62例，29例成功建立PDX模型，成模率為47%，略低于上述報道，推測可能與使用的免疫缺陷動物有關(guān)，上述研究使用的是免疫缺陷程度更高的SCID鼠，免疫缺陷或許能夠提高移植效率[10]。為了有效地利用原發(fā)瘤樣本，探索PDX模型的影響因素，本研究從患者臨床信息和腫瘤病理特征兩方面，統(tǒng)計分析了與PDX模型成模率之間的相關(guān)性，并驗證了原發(fā)瘤與5代PDX模型的一致性。

分析結(jié)果表明，患者的基本情況，年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)和血清CA19-9與成模率無顯著相關(guān)性；患者的既往病史，如是否患有糖尿病與成模率無顯著相關(guān)性；雖然，手術(shù)外的其他輔助治療在胰腺癌患者治療過程中越來越常見[11]，但是與成模率無顯著相關(guān)性；同樣，術(shù)式的不同、腫瘤轉(zhuǎn)移情況與成模率也無顯著相關(guān)性，與報道的胰腺癌PDX模型成模率相關(guān)性分析相一致[12]。評估腫瘤病理因素，同一原發(fā)瘤可能同時存在不止一種細胞分化狀態(tài)，造成腫瘤內(nèi)部的不均一性，這也是腫瘤異質(zhì)性的一種體現(xiàn)方式，以往觀點認為處于低分化程度的腫瘤細胞惡性程度高，對成模率影響較大；但是，本研究的結(jié)果表明無論腫瘤細胞處于何種分化程度對成模影響無顯著差異；推測不同分化程度的腫瘤細胞對新環(huán)境的適應能力才是PDX成模的影響因素。本研究中移植腫瘤的大小與成模率有顯著相關(guān)性，腫瘤>3.5 cm的成模率顯著高于腫瘤<2.8 cm的成模率。術(shù)后取得的原發(fā)瘤標本形狀不規(guī)則，無法用體積衡量，一般使用長度單位計量。有報道稱，腫瘤大小與異質(zhì)性程度和腫瘤細胞代謝活性相關(guān)[13]，而且，腫瘤>3.5 cm是胰腺癌患者預后的獨立影響因素[14]。同時，本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移情況與成模率顯著相關(guān)，表明淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞更具有侵襲性和更高的代謝活性，對新環(huán)境的適應能力也更強，利用此類樣本建立的PDX模型成模率越高[15-16]。本研究并未統(tǒng)計標本離體時間與成模的相關(guān)性，原因是腫瘤標本的采集、運送過程到皮下接瘤全過程用時控制在4 h以內(nèi)，沒有標本離體時間較長的情況發(fā)生。

研究報道，PDX模型會隨著傳代次數(shù)的增加，丟失了原發(fā)瘤的病理特征，失去了異質(zhì)性特征[17]。PDX模型經(jīng)過5～8次傳代后，發(fā)生突變的幾率增大。推測發(fā)生突變的原因是腫瘤適應異體生長環(huán)境而產(chǎn)生選擇性壓力導致的，或許由于原發(fā)瘤中存在低于可檢測范圍的亞克隆過度生長所致[18]。如果移植瘤和原發(fā)瘤的一致性程度不高，PDX模型就失去了對原發(fā)瘤的研究意義，基于PDX模型制定的個體化治療方案就失去了臨床效用。因此，我們對5代PDX模型進行了一致性分析，驗證了經(jīng)過多次傳代后的移植瘤和原發(fā)瘤的一致性。

綜上所述，我們分析了胰腺癌患者的臨床特征和腫瘤病理學特征，探索影響PDX成模率的因素，發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的大小和淋巴轉(zhuǎn)移情況是影響PDX模型成模的重要因素。下一步我們將針對影響腫瘤發(fā)生的相關(guān)分子進行機制研究，深入了解腫瘤大小及淋巴浸潤能力如何影響胰腺癌PDX成模率[19]。同時，擴大樣本量覆蓋更加廣闊的人群，以便研究胰腺癌PDX模型成模的普遍規(guī)律。