BABL/c突變卷毛小鼠免疫學特性指標的分析*

李曉娟 張巧云 湯紫榮 馮 帆 孫慧偉 李 潤 李瑞生

(1. 解放軍第302醫(yī)院臨床研究管理中心，北京 100039)(2. 山東省蓬萊市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，蓬萊 265600) (3. 解放軍第302醫(yī)院疾病預防控制科，北京 100039)

遺傳突變是自然突變動物模型建立的重要途徑之一。由于遺傳基因突變誘導所致突變系小鼠的表型特征比較多樣化，部分表現(xiàn)在外觀體征變異，部分則表現(xiàn)為器官異常甚至功能發(fā)生異常[1]。BALB/c卷毛小鼠是本實驗室在BALB/c小鼠繁殖過程中發(fā)現(xiàn)的自發(fā)突變小鼠，本實驗室通過回交和近交培育以及對其種子資源進行了純化，現(xiàn)已繁殖20代。我們的前期研究結果也提示突變基因?qū)π∈蟮拿庖咂鞴僖约把簩W指標都有一定的影響[2-3]，同時有研究者已經(jīng)對其他類型的突變小鼠的免疫細胞以及免疫功能進行了分析研究[4]，因此本實驗對BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/c小鼠的血常規(guī)免疫細胞指標、血清免疫球蛋白和補體以及與免疫相關的細胞因子進行了檢測，對比分析兩組小鼠各指標之間是否存在差異，旨在探討突變基因是否對小鼠的免疫功能造成一定的影響，為進一步探討B(tài)ALB/c突變卷毛小鼠的應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c突變卷毛小鼠來源于本實驗室近交培育(全同胞兄妹交配)的群體，選擇6周齡BALB/c卷毛小鼠20只(雌雄各10只)；同時選擇6周齡BALB/c小鼠20只(雌雄各10只)，來源于斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號[SCXK(京)2016-0002]，所有小鼠均為清潔級動物。本實驗室具有SPF級實驗動物使用許可證書[SYXK(軍)2017-0010]。飼養(yǎng)室溫度22～23 ℃，相對濕度50%，自由進食和飲水，實驗方案通過了本醫(yī)院倫理委員會的審查。

1.2 試劑盒和儀器設備

KX-21 N全自動血球分析儀(日本Sysmex公司)；5415R離心機(Eppendoff公司)；Model680型酶標儀(伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司)，全自動酶標洗板機(BioTek)，小鼠白介素-2(IL-2)ELISA試劑盒(CSB-04627 m，規(guī)格:48T)；小鼠白介素-4(IL-4)ELISA試劑盒(CSB- E04634m，規(guī)格: 48T)；小鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(CSB- E04741m，規(guī)格:48T)。試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1血液免疫指標測定：從小鼠尾部采血20 μL，用全自動血細胞分析儀檢測以下血常規(guī)指標：中性粒細胞百分比(NE)、中性粒細胞絕對值(NE#)、淋巴細胞百分比(LY)、淋巴細胞絕對值(LY#)、單核細胞百分比(MO)、單核細胞絕對值(MO#)6項指標。

1.3.2血清免疫球蛋白和補體測定：兩組小鼠禁食過夜，用毛細采血管于眼眶后靜脈叢采血1～2 mL，置于EP管中。將血液室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，分離血清，從血清中取出50 μL用于檢測細胞因子，剩余血清送檢驗科檢測指標：免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、補體C3(C3)。

1.3.3血清細胞因子IL-2、IL-4、TNF-α的測定：采用上述分離的50 μL血清，采用ELISA法，按試劑盒說明書方法操作，酶標儀450 nm處檢測吸光度A值，繪制出標準曲線，計算IL-2、IL-4、TNF-α水平。上述所有實驗操作均符合動物福利原則。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/C小鼠血液免疫細胞指標分析

結果顯示：兩組小鼠的NE、NE#和MO雌性及組間結果比較具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，兩組小鼠雌性的LY相比具有顯著性差異(P<0.05)，其它各項指標無差異(表1)。

2.2 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/C小鼠血清抗體和補體分析

結果顯示：兩組小鼠IgM的性別及組間結果比較具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，兩組小鼠IgG和C3的雄性及組間結果比較具有顯著性差異(P<0.01)，其它各項指標無差異(表2)。

表1 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/c小鼠血液免疫細胞的比較Table 1 The contrast of blood immune cells betweenBALB/c mutant curly mouse and BALB/c

注：動物數(shù)為雌雄各10只，與正常BALB/c小鼠比較：*P<0.05，**P<0.01.

Note：10 male and 10 female mice each，compared with normal BALB/c mice*P<0.05，**P<0.01.

表2 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/c小鼠血清抗體和補體指標的比較Table 2 The contrast of antibody and complement betweenBALB/c mutant curly mouse and BALB/c

注：動物數(shù)為雌雄各10只，與正常BALB/c小鼠比較：*P<0.05，**P<0.01。

Note：10 male and 10 female mice each，compared with normal BALB/c mice*P<0.05，**P<0.01.

2.3 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/C小鼠血清細胞因子分析

結果顯示：兩組小鼠IL-4雌性及組間結果相比具有顯著性差異(P<0.05)，其它各項指標無差異(見表3)。

表3 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/c小鼠血清細胞因子指標的比較Table 3 The contrast of serum cell factors betweenBALB/c mutant curly mouse and BALB/c

注：動物數(shù)為雌雄各10只，與BALB/c小鼠比較：*P<0.05

Note：10 male and 10 female mice each，compared with BALB/c mice*P<0.05

3 討論

目前報道有140多個影響被毛及毛發(fā)結構的基因，其中研究最多的是裸基因和無毛基因，無毛基因可表達于皮膚，也可表達于機體的多個部位[5]。同時研究表明突變小鼠由于攜帶無毛基因后，其T細胞和巨噬細胞均會表現(xiàn)功能缺陷，而突變基因還會隨著小鼠的成長影響胸腺等免疫器官的結構及功能[6]。王冬平等[7]對無毛小鼠的胸腺和淋巴細胞亞群進行了檢測，發(fā)現(xiàn)突變小鼠的胸腺萎縮且淋巴細胞稀疏。史崇敏等[8]對無毛小鼠與有毛小鼠的免疫器官及功能進行了對比，發(fā)現(xiàn)在免疫組織學以及免疫細胞和細胞因子方面均存在顯著性差別。而目前國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)突變卷毛小鼠品系的有關情況，本實驗室發(fā)現(xiàn)的BALB/c卷毛小鼠也未曾對其免疫細胞以及細胞因子進行對比分析。

因此，本實驗選取6周齡BALB/c突變卷毛小鼠和BALB/c小鼠，對其血液免疫細胞、血清抗體補體以及血清細胞因子進行了相應的測定分析，結果顯示：BALB/c突變卷毛小鼠血液的中性粒細胞、淋巴細胞以及單核細胞顯著低于BALB/C小鼠，此結果提示突變基因可能造成了血液中免疫細胞的減少。本實驗的血液抗體檢測結果顯示：兩組小鼠IgA的結果未發(fā)現(xiàn)差異具有顯著性，IgA在黏膜免疫中發(fā)揮著重要的抗病毒作用，能將病毒吸附到黏膜上皮細胞從而筑起第一道防線[9]，因此提示BALB/c卷毛小鼠的皮膚在預防外界病毒方面的功能與BALB/c小鼠不具有差異。但實驗結果顯示BALB/c卷毛小鼠IgM、IgG和C3顯著低于BALB/c小鼠，IgM為體液免疫出現(xiàn)最早的抗體，通常將IgM作為判斷感染的指標[10]。IgG可以中和毒素和病毒，還能夠調(diào)理吞噬細胞的吞噬作用[11]。因此提示BALB/c卷毛小鼠可能在感染早期和對抗外毒素以及吞噬病毒作用方面的能力均低于BALB/c小鼠。目前研究表明IL-2是機體內(nèi)最主要的T細胞生長因子[12]，TNF-α可增強IL-2依賴的胸腺細胞、T細胞增殖能力，同時TNF-α有明顯的促炎活性和免疫調(diào)節(jié)作用[13]。本實驗結果顯示BALB/c卷毛小鼠的IL-2、TNF-α與BALB/c小鼠不存在差異，提示BALB/c卷毛小鼠與BALB/c小鼠在促炎方面可能不存在差異。而由T淋巴細胞亞群分泌的IL-4能夠增強殺傷性T細胞和NK細胞的殺傷活性[14-15]。而BALB/c卷毛小鼠的IL-4顯著低于BALB/c小鼠，提示BALB/c卷毛小鼠的淋巴細胞殺傷性作用可能略低于BALB/c小鼠。綜上所述，本實驗結果提示突變基因?qū)π∈蟮拿庖吖δ墚a(chǎn)生了影響，降低了卷毛小鼠對外源物質(zhì)的清除能力，和機體的抗病毒和吞噬能力，推測此BALB/c卷毛小鼠可能為腫瘤移植實驗提供良好的動物模型。下一步我們將利用此BALB/c卷毛小鼠進行腫瘤移植方面的研究，以期能夠為臨床研究提供良好的小鼠腫瘤模型。

綜上所述， 本實驗初步對BALB/c突變卷毛小鼠的血液免疫學指標進行了檢測分析，旨在發(fā)現(xiàn)BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/C小鼠之間存在的差異以及差異程度，結果顯示卷毛小鼠的免疫功能出現(xiàn)了減弱的現(xiàn)象，為BALB/c突變卷毛小鼠的進一步開發(fā)利用提供了基礎資料。